王福俤/闵军霞/郑树森院士团队在肝纤维化及肝硬化防治领域获得重大突破

　　该研究通过在国际上率先构建的肝实质细胞特异敲除转铁蛋白基因的小鼠模型，展现出机体组织铁蓄积、铁死亡及肝纤维化的系列典型病理特征

　　

近日，国际权威学术期刊《血液学》(Blood，影响因子16.6)在线发表了浙江大学医学院王福俤教授、闵军霞教授和郑树森院士团队合作研究新成果。论文题目为 “Hepatic Transferrin Plays a Role in Systemic Iron Homeostasis and Liver Ferroptosis”【1】（图1）。该成果系统揭示并阐明肝脏转铁蛋白（Transferrin, Trf）通过调控铁死亡抑制肝脏损伤、纤维化及肝硬化发生的功能及致病分子机制。该研究通过在国际上率先构建的肝实质细胞特异敲除转铁蛋白基因的小鼠模型，展现出机体组织铁蓄积、铁死亡及肝纤维化的系列典型病理特征；并进一步功能筛选发现金属膜蛋白Slc39a14（Zip14）是转铁蛋白缺失引发的组织器官铁蓄积的关键转运蛋白；阐明敲除Slc39a14能够完全逆转非转铁蛋白结合铁（NTBI）蓄积以及肝细胞铁过载导致的肝细胞铁死亡和肝纤维化。该重大研究成果不仅为防治肝损伤、肝纤维化及肝硬化等疾病提供了新靶点（转铁蛋白及Slc39a14），而且为进一步深入研究肝纤维化及肝硬化的致病机制提供了新思路。

肝脏纤维化是多种致病原因所致的慢性肝脏损伤后发生的肝内结缔组织异常增生性疾病，长期发展会导致肝硬化，是一种世界范围内较为常见的致死病因。目前，除肝脏移植外，针对肝纤维化及肝硬化尚缺乏有效治疗措施【2】。因此，早期发现及预防肝损伤、肝纤维化及肝硬化的发生对于改善肝脏疾病的转归及预后至关重要。

长期以来，人们早就观察到肝脏组织中铁过载与肝功能障碍密切相关，但铁过载是否直接引发肝脏损伤及其发生机制尚不明确。比如早在19世纪，人们认识到以铁过载为主要病理特征的血色病（Hemochromatosis）。遗传性血色病是一种常染色体隐性遗传病，在欧美人群中发病率较高（约为1/200）。已知其发生主要由于铁代谢调控基因（HFE, HJV, HAMP, TFR2, FPN）突变所导致的铁的过量摄取和组织内铁蓄积，患者晚期多发展为肝硬化、肝癌、糖尿病和心血管疾病等，严重危害人类健康【3】。王福俤/闵军霞教授团队2017年在肝脏研究领域国际著名期刊《肝病学》（Hepatology）发表了题为“Characterization of Ferroptosis in Murine Models of Hemochromatosis”的封面论文（图2），该研究成果在全球首次利用多种铁过载性基因敲除小鼠模型发现并阐明铁死亡是铁过载诱发肝脏损伤中的重要致病机制【4】。该成果在小鼠体内首次揭示胱氨酸转运蛋白Slc7a11通过调控铁死亡参与铁过载小鼠肝损伤的发病机制而备受国际学术界重视。

近期，王福俤/闵军霞/郑树森院士团队合作在铁死亡调控肝损伤领域的深入探索过程中发现转铁蛋白缺失是导致铁死亡引发肝损伤、肝纤维化及肝硬化的主要病理机制。转铁蛋白是血液循环中的含铁蛋白之一，主要由肝脏分泌，通过结合并将血液循环中的铁离子转运到机体的各组织器官中利用。血液循环中的铁离子有多种存在方式，其中转铁蛋白结合铁（Transferrin Bound Iron, TBI）是最主要的存在方式，其余少量不与Transferrin 结合，统称为非转铁蛋白结合铁（Non-Transferrin Bound Iron, NTBI），NTBI增多会诱导氧化自由基产生并导致细胞毒性。

为了研究转铁蛋白在肝脏组织中的功能，研究者首先利用Cre/loxP技术构建了编码转铁蛋白（Transferrin, Trf）基因的肝实质细胞特异性敲除小鼠（Trf-LKO）。研究发现肝实质细胞特异敲除Trf后，小鼠铁调素Hepcidin表达水平下降，全身铁代谢发生明显紊乱；小鼠主要表现为造血异常、血清中NTBI水平急剧升高同时伴随肝脏中铁离子蓄积，并在6-12月龄时观察到肝脏脂质过氧化损伤。进一步在高铁饲喂以及慢性四氯化碳注射的两种常用肝纤维化动物模型中，研究者们发现肝实质细胞特异性敲除Trf小鼠出现严重肝纤维化的表现，并伴随肝脏脂质过氧化损伤增强、铁死亡调控基因表达异常。这些数据提示铁死亡在低转铁蛋白相关的肝纤维化发生中可能发挥作用。

进一步探索机制过程中，研究人员给上述疾病模型小鼠腹腔注射铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1），发现Fer-1治疗组小鼠的肝纤维化表型明显缓解，表明细胞铁死亡是低转铁蛋白相关的肝纤维化发生的关键致病机制。

接下来的关键科学问题是：在肝脏缺乏转铁蛋白时，为什么NTBI会进入肝脏并在肝脏蓄积？通过对Trf-LKO小鼠金属转运蛋白的筛选，研究人员锁定金属离子转运蛋白Slc39a14。有趣的是，王福俤团队前期曾报道该蛋白在生理条件下主要转运锰离子【6】。为明确这一关键问题，研究团队在国际上首次成功制备了肝实质细胞特异性敲除Trf和Slc39a14的双基因敲除小鼠模型(DKO)，并且惊喜地发现，抑制Slc39a14的表达能明显改善肝脏NTBI的蓄积，并显著减轻脂质过氧化及铁死亡引发的肝损伤，从而成功逆转了肝实质细胞Trf敲除小鼠的铁死亡及其诱发的肝纤维化。这些结果不仅进一步明确了NTBI蓄积是诱发肝脏铁死亡的分子机制，同时提示Slc39a14有望成为治疗低转铁蛋白及铁死亡相关肝脏疾病的重要靶点。

小鼠的这些系列发现是否与临床相关疾病有关？为了进一步探究临床患者转铁蛋白与肝纤维化关联特征，研究人员通过分析肝硬化患者和正常健康对照的血清学指标，发现肝硬化患者的血清转铁蛋白水平显著低于健康对照人群；并且肝硬化患者的肝纤维化四项与血清转铁蛋白水平之前存在显著负相关。这些临床相关分析进一步提示转铁蛋白缺乏在肝纤维化/肝硬化的发生发展中可能扮演重要角色。此外，基于肝硬化患者的肝穿样本的检测结果，发现肝硬化患者的肝脏转铁蛋白水平明显减少，而肝脏铁水平及SLC39A14蛋白表达水平明显增高，进一步表明转铁蛋白缺乏的肝纤维化/肝硬化患者可能通过SLC39A14吸收NTBI，随后激发了脂质过氧化性肝损伤、肝纤维化及肝硬化。这些数据提示抑制铁死亡或SLC39A14有望成为潜在的防治肝硬化的治疗方式。

总之，该重大成果的主要突出贡献为：（1）首次成功制备转铁蛋白组织特异性敲除小鼠模型，为研究转铁蛋白的组织来源及功能提供新型动物模型；（2）阐明了肝脏转铁蛋白缺乏通过铁死亡促发肝纤维化的分子机制；（3）首次明确SLC39A14是组织器官铁离子过载的转运蛋白，解析了困扰科学界半个多世纪的难题；（4）阐明补充转铁蛋白以及抑制铁死亡或SLC39A14能够有效预防及缓解肝纤维化发生发展，为肝纤维化及肝硬化的防治提供了重要新靶点。该成果不仅丰富和阐明肝脏疾病铁死亡发生的分子调控机制，同时为肝脏疾病诊治提供了新靶点和新策略。

王福俤团队博士研究生余盈盈和蒋丽为共同第一作者；浙江大学医学院王福俤教授、闵军霞教授和郑树森院士为共同通讯作者。浙江大学附属第一医院沈哲医师及美国哈佛大学医学院/麻州总医院Raymond T. Chung教授和Tuo Shao博士后参与了部分工作。浙江大学附属第一医院虞朝辉教授及陈保德副主任技师为临床对接提供了帮助。该研究成果得到国家重点研发计划、国家自然科学基金以及中国博士后科学基金的经费资助。

Blood杂志论文链接：

https://ashpublications.org/blood/article/doi/10.1182/blood.2019002907/454783/Hepatic-Transferrin-Plays-a-Role-in-Systemic-Iron

 

参考文献

【1】Yingying Yu#, Li Jiang#, Hao Wang, Zhe Shen, Qi Cheng, Pan Zhang, Jiaming Wang, Qian Wu, Xuexian Fang, Lingyan Duan, Shufen Wang, Kai Wang , Peng An, Tuo Shao, Raymond T Chung, Shusen Zheng*, Junxia Min*, Fudi Wang*(王福俤).Hepatic Transferrin Plays a Role in Systemic Iron Homeostasis and Liver Ferroptosis. Blood. doi: 10.1182/blood.2019002907. Online ahead of print.

【2】Vilar-Gomez E, Calzadilla-Bertot L, Wai-Sun Wong V, Castellanos M, Aller-de la Fuente R, Metwally M, Eslam M, Gonzalez-Fabian L, Alvarez-Quinones Sanz M, Conde-Martin AF et al: Fibrosis Severity as a Determinant of Cause-Specific Mortality in Patients with Advanced Nonalcoholic Fatty Liver Disease: A Multi-National Cohort Study. Gastroenterology 2018, 155(2):443-457.e417.

【3】Pietrangelo A: Hereditary hemochromatosis--a new look at an old disease. The New England Journal of Medicine 2004, 350(23):2383-2397.

【4】 Hao Wang, Peng An , Enjun Xie, Qian Wu , Xuexian Fang , Hong Gao, Zhuzhen Zhang, Yuzhu Li, Xudong Wang, Jiaying Zhang , Guoli Li, Lei Yang, Wei Liu, Junxia Min*, Fudi Wang*(王福俤). Characterization of ferroptosis in murine models of hemochromatosis. Hepatology 2017; 66:449-465.

【5】Nermi L. Parrow, Yihang Li, Maria Feola, Amaliris Guerra, Carla Casu, Princy Prasad, Luke Mammen, Faris Ali, Edvinas Vaicikauskas, Stefano Rivella, Yelena Z. Ginzburg, Robert E. Fleming. Lobe specificity of iron binding to transferrin modulates murine erythropoiesis and iron homeostasis. Blood. 2019; 134171373–1384 doi: https://doi.org/10.1182/blood.2018893099

【6】Yongjuan Xin#， Hong Gao#, Jia Wang#, Yuzhen Qiang, Mustapha Umar Imam, Yang Li, Jianyao Wang, Ruochen Zhang, Huizhen Zhang, Yingying Yu, Hao Wang, Haiyang Luo, Changhe Shi, Yuming Xu, Shintaro Hojyo , Toshiyuki Fukada, Junxia Min, Fudi Wang*(王福俤). Manganese transporter Slc39a14 deficiency revealed its key role in maintaining manganese homeostasis in mice. Cell Discovery 2017; 3:17025.