干货！专家谈细胞株开发的4个关键步骤

　　来自Pathway Biopharma的CEO Jon Dempsey博士指出，由于CLD和首批临床药物的开发正处于将新型疗法推向临床试验的关键阶段，因此公司正在寻求采取一切可能的措施来加快开发过程。

　　

细胞株开发（Cell line development，CLD）的过程与生物药开发的早期所涉及过程有所不同。创建稳定的用于生产的高产细胞株的步骤包括：宿主细胞株选择，表达载体工程，转染，克隆和细胞扩增，以及各种筛选步骤，从而选择细胞活力高，生长能力强，并且表达水平、以及表达的稳定性、质量情况都具有最高表现的单克隆细胞株。这一过程，不同的企业平台也可以采用许多不同的策略来优化其工作流程，而其中的筛选过程直接决定了细胞形成优质单克隆细胞株的水平，因而显得尤为重要。

Jon Dempsey博士，Pathway Biopharma的首席执行官兼创始合伙人。Jon博士在生物制药行业工作了近30年，在生物化学，制造和控制（CMC）方面拥有专业知识，包括细胞系开发，细胞疗法和工艺开发，分析和蛋白质化学，CDMO选择和制造。并参与了几种生物疗法的商业开发。

一些经验丰富的专家，也对此有着深刻的见解。来自Pathway Biopharma的CEO Jon Dempsey博士指出，由于CLD和首批临床药物的开发正处于将新型疗法推向临床试验的关键阶段，因此公司正在寻求采取一切可能的措施来加快开发过程。如果今天我要构建CLD系统，那么我将首先谈到以下四个阶段：

1. 工作流程的制定，然后在过程中使用定向进化或克隆选择来设计适合此工作流程的细胞系。
2. 使用合成载体技术，从而促进表达。
3. 运用自动化平台Cyto-Mine®，消除单轮细胞克隆的过程，从而消除手工流程，加速进程。
4. 减少细胞倍增时间，使工作尽可能的聚焦于细胞快速生长。

制定工作流程并选择合适的细胞系

目前，几乎所有抗体药的生产都来自于中华仓鼠卵巢（CHO）细胞，这一细胞系也是重组生物药主要使用的细胞系，符合FDA批准的监管途径，因此这一细胞系也有助于后续相关药物的上市流程。另外，CHO还符合悬浮培养，可在无血清，无动物来源的化学成分的明确培养基中生长，可实现大规模生产及具有更高的重现性。另外，CHO细胞提供了“人样”糖基化特征，可以阻止患者免疫反应的激活，从而导致不良副作用或产品功效丧失。

在CLD的过程中，定向驯化提供了一种更有效的方法来生成改良的哺乳动物细胞宿主，可用于优化CLD过程。定向驯化可能涉及富集和分选细胞系，以分离出表现出所需生产特性的亚克隆，然后将这些亚克隆用作宿主亲本细胞系，以确保它们能够在发育过程中生长（图1）。

图1：定向驯化过程

运用合成启动子的载体

表达载体实质上是一段DNA，例如包含了抗体基因和选择标记基因，以及允许在CHO细胞中表达的基因之类元件的一段DNA序列。选择标记基因的主要目的是加快遗传载体在宿主细胞系中的表达。用于CHO细胞的经典选择标记包括谷氨酰胺合成酶（GS）和二氢叶酸还原酶（DHFR）。通常，选择标记基因由最常见的病毒或内源启动子调控。但是，病毒和内源性启动子可能具有不可控或者是无法预测的功能和风险。而这对于工业规模的流程来说并不理想。因此，合成启动子优化蛋白表达的探索成为了新的契机。而合成启动子与病毒启动子相比，具有可预测的功能，并提供更多的转录控制，以促进生物制药生产的研发。例如，可以设计CHO的在基因治疗疫苗中作用不同的启动子。每个启动子仅在特定条件或位置，例如特定的组织条件下实现表达。

用自动化平台代替手动的筛选流程

传统的方法，往往采用手动的有限稀释法进行筛选。这种劳动密集的过程依赖于液体稀释以及显微镜目测筛选来鉴定和选择单个细胞。尽管这一方法温和直接，但通量低，操作复杂的流程也极易造成污染。由于有限稀释依赖于统计分布，因此这种迭代克隆筛选技术至少需要两轮才能提高单克隆性，并且需要花费大量时间。为了解决这个问题，一些公司只对早期试验进行单轮克隆，如果药物不成功，则将不会进行第二轮的单克隆筛选。

一些团队也开发了其他的平台用于单克隆的筛选，例如目前比较流行的流式细胞分选方法，通过荧光检测细胞表面蛋白的表达水平，进而分离细胞。但这一方法不仅操作复杂，并且流式分选还会带来高剪切力，以及本身无法检测外泌型蛋白。这一系列的技术限制，往往也会在分选过程中，对细胞造成不可逆的损伤，影响细胞的活力和完整性。近年来，一些自动化单克隆挑选成像平台，例如ClonePix，确实也可以解决以上面临的诸多问题。但也引入了假阳性这一难以解决的新问题。

随着近几年微流控技术的发展，以油包水方式进行单细胞分选的技术也已愈加成熟。为改进传统的分离单细胞方法提供了完全不同的创新技术平台。英国Sphere Fluidics公司生产的Cyto-Mine®高通量微流控单细胞分析筛选系统，使用微滴包裹的技术，短时间内，迅速将成千上万个单细胞分离包裹，形成数百皮升的微小液滴，使得每个液滴都成为细胞培养和检测单个细胞的独立体系。通过对单细胞表达分泌水平的检测，可以在几小时内迅速对表现出最高的抗体表达水平的细胞进行检测和筛选，进而将其分选至培养板中单独的孔内。由于整个过程中，细胞包裹于液滴中，免于遭受来自流体中剪切力的影响，从而保证了大量有价值的单细胞更易于形成单克隆。

图2：短时间内，迅速将成千上万个单细胞分离包裹，形成数百皮升的微小液滴

另外，Cyto-Mine平台还整合了高速成像技术，可对微流控管道中流动的液滴进行图像采集。通过分析液滴中细胞的个数，自动化的为筛选细胞的单克隆源性提供证据。以上的流程都集成于一台系统中完成，而全部流程也仅仅需要数小时的时间，在一个工作日内即可轻松完成1~2次筛选过程，大大节约了时间成本。

图3：高速图像采集，分析液滴中细胞的个数，自动化的为筛选细胞的单克隆源性提供证据

与其简单地使现有的CLD工作流程自动化（多年来未曾改变），不如说现在是时候通过重新构造和优化工作流程以使其更加自动化来重新思考和检修人工，劳动密集型步骤。您可以使用Cyto-Mine®等仪器来实现这种简化的优化。后者使细胞分离，滴度测定和克隆性保证自动化，从而提供了可靠的一步克隆策略。这样，完全集成的平台可以使工作效率评估更早，更快速地完成，并且工作量更少。Cyto-Mine®还消除了两轮限制性稀释克隆的需要，大大节省了证明单克隆抗体所需的时间和资源。

图4：不同方法进行单克隆筛选的比较

目前大多数现有的CLD工作流程自动化，并没有在本质上通过改善工作流程、打破劳动密集型工作来对整体的工作流程进行重新构造和优化。而Cyto-Mine®等平台的加入，使得优化的选择变得更加的简便。随着自动化完成滴度测定和克隆性保障的工作，从而提供了可靠的一步法克隆策略。这样，可以在完全集成的平台上更为快速地完成CLD的工作，大大减少了额外的工作量。Cyto-Mine®平台的使用，可不必再进行两轮限制性稀释的克隆生长，也大幅度节省了验证单克隆源性所需的时间和相应资源。

细胞生长

通常细胞不是单个实体，并不愿意被分离成单个细胞。单细胞的处理和分选会极大地影响单个克隆中细胞的回收。为了促进单细胞生长，细胞需要旺盛的支持环境。因此无论是否优化了单细胞克隆，细胞生长都是CLD科学家面临的挑战。

通常细胞的生长会受到其自身分泌的生长因子的影响。在批量培养中，细胞被影响其生长的物质所包围。这些分子可以促进或抑制细胞增殖。例如，CHO细胞会分泌具有信号传导性的化合物，这些化合物具有自刺激性，但也可以作为整体细胞生长的外部刺激物。

而当细胞被分离为单细胞时，缺乏这些刺激性物质，可能会对细胞的生长造成巨大的影响。另外，细胞自己也具有特殊的感知环境的能力。因此当细胞被分离为单细胞时，大部分支持环境受到改变，这也会阻止它们的生长。但目前还没有一种普适的方法适应于所有情况下的单细胞生长。不同的CHO细胞类型和克隆都具有不同的营养需求。因而必须针对每种独特的细胞株，优化相应的生长培养条件，以支持分离到的单细胞克隆的获得最佳的存活机会。

小结

近几年，生命科学领域的进步，不断优化了CLD的流程。优化整合的CLD流程的关键步骤包括：1.工作流程的制定，然后在过程中使用定向进化或克隆选择来设计适合此工作流程的细胞系。2.使用合成载体技术，从而促进表达。3.运用自动化平台Cyto-Mine®，消除单轮细胞克隆的过程，从而消除手工流程，加速进程。4.减少细胞倍增时间，使工作尽可能的聚焦于细胞快速生长。

值得注意的是，没有一种解决方案适合所有单元。CLD工作流程的每个阶段都需要针对特定的克隆进行优化。如果依然基于传统的思维，很难在工作流程中开启真正意义上优化的机会，难以重新设计和整合新的流程。但随着自动化细胞生物学平台的建立，可以逐步对相应的流程进行优化。这也是减少劳动密集型流程，缩减工作量，降低风险的有效方式。

基于历史观点，使用传统工作流的个人可能没有机会回去设计或整合新的流程，例如定向进化。但是，可访问的，易于使用的自动化和细胞生物学平台的可用性可以帮助以逐步的方式促进过程优化。这提供了低风险和最小的工作量，并具有加速的CLD的潜在回报并减少了劳动密集型流程。

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