基因组改造技术之CRISPR–Cas系统

　　目前 CRISPR/Cas9技术已成功应用于人类细胞、小鼠、斑马鱼、果蝇、烟草、水稻及拟南芥等真核生物的基因编辑中，并取得一系列重要的科研成果。近年来，该技术也逐步被用于对微生物的研究中，利用 CRISPR/Cas9系统可对微生物的基因进行敲除、插入、沉默和定向调控等，并通过相关实验推测基因功能。

　　

CRISPR-Cas系统的发现

日本大阪大学的科研人员在1987年发现大肠杆菌(E. coli)的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）基因终止密码子的3’端方向还存在一小段不同寻常的DNA元件，这些片段是由长为29bp的简单重复序列组成的，而且在每段重复序列之间还存在一段不太长的（32bp）特有序列。而这一段简单重复序列的中段，还有14个bp的回文区域。

至于这段序列的功能，当时既“没有在其他原核生物中发现其同源序列，也不清楚这些序列的生物学意义。”（PMC213968, Ishino et al., J. Bacteriol, 1987, 169(12), 5429-5433.）

在2002年的一篇文章中（Jansen et al., Mol. Microbiol., 2002, 43, 1565-1575），这种DNA元件的命名统一为CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，规律成簇的间隔短回文重复）。这篇文章在CRISPR区域附近（大多数距离CRISPR区域不超过1kb，最远距离为9kb）发现了四个CRISPR相关基因(CRISPR-associated genes, cas1~4)。此外，根据氨基酸序列，Jansen等预测Cas1可能是DNA结合蛋白类似，Cas3可能具有DNA解旋酶的部分结构域，而Cas4与RecB核酸外切酶有相似结构。

在使用数据库进行分析后，Mojica等发现，CRISPR中的间隔序列可能与原核生物对噬菌体和质粒的防御机制有关，只要某种原核生物带有与另一种噬菌体或质粒序列相同的CRISPR间隔序列，它就无法被噬菌体攻击，或被相关质粒稳定地转化。（Mojica et al., J. Mol. Evol., 2005, 60, 174-182）。

巴黎第十一大学的Pourcel和Vergnaud等人在利用CRISPR序列的演化过程来追踪鼠疫耶尔森氏菌(Yersenia pestis)不同亚种的演化过程时发现，耶尔森菌属的两个种之间分享了序列信息和来源物种都相同的CRISPR间隔序列，但这两个种在至少4100万年以前已经在演化过程上分离。因此它们的CRISPR应该是在这一时间节点以后获得间隔序列信息的。因此，这篇文章的作者们还提出Cas蛋白具有向CRISPR元件中加入或删除间隔序列的功能的假说（Pourcel et al., Microbiology, 2005, 151, 653-663）。

另一组以Bolotin为首的研究人员也发现CRISPR的间隔序列中，有相当一部分已知来源的序列来自于噬菌体。并且他们还发现了cas1B、cas5和cas6三个CRISPR相关基因（这里的cas5其实就是我们所熟知的cas9）。最重要的是，他们确认了嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)CRISPR区域中间隔序列的数量越多，其对噬菌体的敏感程度越低（Bolotin et al., Microbiology, 2005, 151, 2551-2561）。就此，他们得出结论，认为CRISPR通过间隔序列来识别外界噬菌体的基因序列。

到了2007年，CRISPR系统的功能得到了实验的直接确认（Barrangou et al., Science, 2007, 315, 1709-1712）。研究人员发现嗜热链球菌对CRISPR间隔序列完全吻合的噬菌体才有抗性，而对存在SNP的同种噬菌体的其它品系则毫无抗性。其次，在敲除了对应的间隔序列以后，细菌就丧失了对相关噬菌体的抗性。最后，本文通过indel实验，发现CRISPR相关的噬菌体抗性既需要间隔序列的完美匹配，也需要cas5蛋白（这个蛋白后来改名为cas9）的参与。

2008年van der Oost等人通过逐个敲除大肠杆菌体内cas相关基因和Northern Blot实验，证明了大肠杆菌的CRISPR/cas系统是通过合成带有茎环结构和间隔序列的小分子crRNA来起作用的。而这种小分子crRNA所针对的靶位点也不是噬菌体的RNA，而是其DNA（Brouns et al., Science, 2008, 321, 960-964）。

2008年，美国西北大学的Marraffini和Sontheimer发现，CRISPR可以抑制与间隔序列一致的质粒的接合和转化现象，而这一过程是通过直接对DNA的操作而实现的。同样是在这篇文章中，作者们设想可以通过更改crRNA的序列来对CRISPR进行操作，从而阻止致病菌通过质粒或噬菌体而获得抗生素的抗性，这可能是对CRISPR的实际应用（而非基础研究）的最早的创意（Marraffini and Sontheimer, Science, 2008, 322, 1843-1845）。

Barrangou、Moineau与同事们发现，CRISPR/Cas系统利用cas5的核酸内切酶活性（现在叫cas9）的切割位点位于PAM（原间隔序列相邻基序,proto-spacer adjacent motif）区域上游的3个bp处（也就是crRNA的序列的3’末端）（Garneau et al., Nature, 2010, 468, 67-71）。

Charpentier和Deltcheva等发现，酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)细胞内有一种名为tracrRNA的含量很高的小分子RNA，可以通过碱基互补配对与crRNA结合，并在Cas9和细菌的RNase III的协助下，对crRNA进行剪切，使其具备完整的功能（Deltcheva et al., Nature, 2011, 471, 602-607）。随后，Charpentier、Doudna和Jinek等进一步确定了Cas9的功能和PAM的具体序列（Jinek et al., Science, 2012, 337, 816-821），作者们在这篇文章中提出了Cas9替代锌指核酸酶和TALEN来进行基因组精准操作的可能，并为此设计了使用sgRNA来代替tracrRNA和crRNA以引导Cas9的实验。

将CRISPR系统用于哺乳动物的基因编辑（Cong et al. Science, 2013, 339, 819-823）
将crRNA和tracrRNA整合为一个sgRNA（Hwang et al. Nat Biotechnol, 2013, 31, 227-229）

自然界中的CRISPR/Cas9系统

综上所述，CRISPR/Cas是广泛存在于细菌及古菌中的一种后天免疫系统，是这些微生物为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。据不完全统计，绝大多数古菌和大约三分之一的细菌拥有CRISPR/Cas系统。它可利用靶位点特异性的RNA指导Cas蛋白对靶位点序列进行修饰。

自然界中CRISPR系统执行功能的基本原理是，Cas9内切酶在RNA的指引下能够对各种入侵的外源DNA分子进行定点切割。如果要形成一个有功能的DNA切割复合体，还需要另外两个RNA分子的帮助，它们就是CRISPR RNA(crRNA)和反式作用CRISPR RNA（tracrRNA)。crRNA通过碱基配对与tracrRNA结合形成复合物，并引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的DNA序列靶位点处进行切割，形成DNA双链缺口。而CRISPR/Cas的其他蛋白成员则可以向CRISPR区域中的间隔序列插入新的来自噬菌体或质粒的外源序列，使其宿主获得对这些外源DNA的识别和剪切能力。

使用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑

自从2013年张锋等实现了使用CRISPR/Cas9系统进行哺乳动物细胞的基因操作以来，在NCBI pubmed数据库中介绍或采用这一基因组改造技术进行相关研究的文献已经有39000多篇。

用于精确基因编辑的CRISPR/Cas9系统与自然界中的同类主要存在两个差异，其一是使用特别设计的sgRNA替代了宿主基因组内的crRNA和tracrRNA，一方面通过减少组分实现了实验的简化，一方面可以通过设计sgRNA的具体序列来实现精准的靶向编辑，其中包含两个区域：sgRNA 5'端前20个核苷酸对应于DNA的靶位点，能结合在DNA上；约60个核苷酸形成一个发夹结构，能帮助sgRNA与Cas9结合。另一个差异是Cas9剪切DNA靶位点产生双链缺口后，通过人工的方法实现核苷酸替换/插入、长片段的插入或敲除、亦或是使用同源重组方法进行基因片段的替换或构建融合蛋白。

目前 CRISPR/Cas9技术已成功应用于人类细胞、小鼠、斑马鱼、果蝇、烟草、水稻及拟南芥等真核生物的基因编辑中，并取得一系列重要的科研成果。近年来，该技术也逐步被用于对微生物的研究中，利用 CRISPR/Cas9系统可对微生物的基因进行敲除、插入、沉默和定向调控等，并通过相关实验推测基因功能。北京亿鸣复兴生物（www.ymbio.com）聚焦微生物基因编辑领域，组建微生物专业研究团队，依托强大的微生物和分子生物学专业背景，根据不同细菌和真菌的特性，选用不同的编辑策略，已成功在铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌、乳酸菌、芽孢杆菌、白色念珠球菌、酿酒酵母、黑曲霉等十几种细菌及真菌中建立了成熟的CRISPR/cas9基因编辑体系。北京亿鸣复兴生物（www.ymbio.com）提供从生物信息学分析、基因编辑分子实验、细胞实验、动物模型制作的一站式技术服务，可以实现包括gRNA设计、CRISPR/Cas9载体构建、细胞转染、阳性克隆鉴定、单克隆细胞培养、基因敲除细胞系构建等服务。

在肺炎克雷伯杆菌中利用结合λRed重组系统的CRISPR/Cas9体系进行敲除株构建

在白色念珠球菌中利用CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein复合物进行敲除株构建

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