三位学者Science最新报道：利用CRISPR技术追踪单个癌细胞

　　怀特海德研究所的Jonathan Weissman利用CRISPR技术跟踪单个癌细胞的谱系，实时了解它们的增殖和转移情况

　　

当癌症只出现在人体内某个部位的时候，医生通常可以通过手术或其他疗法来治疗。然而，与癌症相关的大部分死亡率是由于其转移，癌细胞会到处播种可能在整个人体生根的种子。转移是瞬时的，在肿瘤的数以百万计的分裂过程中一瞬即过。“这些事件通常是不可能实时监控的”，来自怀特海德研究所的Jonathan Weissman教授说。

而最近，Weissman教授与加州大学伯克利分校的计算机科学家Nir Yosef，以及加州大学旧金山分校的癌症生物学家Trever Bivona合作，将CRISPR工具变成了一种能达到以上目标的工具。

他们用进化生物学家的角度分析了癌细胞，追踪癌细胞错综复杂的家谱。而且研究人员通过分析这些“进化树”，可以发现单个癌细胞何时开始侵袭，转移到身体的其他部位。

这一成果公布在Scienc杂志上。

Weissman教授说：“通过这种方法，我们还可以问类似的问题：这种肿瘤多久发生一次转移？转移从何而来？它们从何而来？通过在体内追踪肿瘤的历史，可以揭示了肿瘤生物学上原本不可见的差异。”

每种颜色代表身体的不同位置。一个五颜六色的图集显示出高度转移的表型。

过去，科学家通过比较共享突变和DNA蓝图的其他变异来追踪癌细胞的谱系。但是，这些方法在一定程度上取决于是否有足够的自然发生的突变或其他标记来准确显示细胞之间的关系。

这项研究中，研究人员不只寄希望于癌症谱系包含足够的谱系特异性标记物来追踪，而是决定使用实验室成员Michelle Chan的方法，添加标记物。

“从根本上说，这个想法是设计一种具有DNA基因组‘scratchpad’的细胞，然后可以使用CRISPR对其进行'written。”基因组中的这种“written”以可遗传的方式进行，这意味着细胞的祖辈将在其基因组中记录其亲代细胞和祖父母细胞的“written”。

为了创建这些特殊的“scratchpad”细胞，Weissman设计了具有附加基因的人类癌细胞：一种用于细菌蛋白Cas9，另一种用于发光蛋白（显微镜检测），另外一些用于可用作CRISPR技术靶标的序列。

然后，他们将成千上万种经过修饰的人类癌细胞植入小鼠体内，模仿肺部肿瘤（由Bivona开发的模型）。患有人类肺部肿瘤的小鼠通常表现出侵袭性转移，因此研究人员认为它们将提供实时跟踪癌症进展的良好模型。

随着细胞开始分裂，Cas9在这些靶位点进行了小切口。当细胞修复切口时，它会修补或删除一些随机核苷酸，从而形成称为插入缺失的独特修复序列。这种切割和修复几乎在每一代人中都是随机发生的，从而创建了一张细胞分裂图，研究团队随后可以使用他们与计算机科学家Yosef共同创建的特殊计算机模型进行追踪。

发现癌细胞的秘密

以这种方式跟踪细胞产生了一些有趣的结果。一方面，单个肿瘤细胞彼此之间的差异远远超出了研究人员的预期。研究人员使用细胞来自已建立的人类肺癌细胞系A549。“你会认为它们会相对同质。但是实际上，即使在同一只小鼠中，我们也看到了不同肿瘤转移倾向的巨大差异。一些肿瘤的转移事件非常少，而其他肿瘤的转移很快。”

为了弄清楚这种异质性来自何处，研究小组将同一细胞的两个克隆植入了不同的小鼠体内。随着细胞的增殖，研究人员发现它们的后代转移的速率非常相似。同一细胞系中不同细胞的后代并非如此：原始细胞显然具有不同的转移潜能，因为该细胞系维持了许多代。

接下来，科学家们想知道哪些基因导致同一细胞系中癌细胞之间的这种变异性。因此，他们开始寻找在非转移性，弱转移性和高度转移性肿瘤之间表达差异的基因。

许多基因脱颖而出，其中一些以前被认为与转移有关，不过现在尚不清楚它们是在推动转移还是只是其附带作用。其中之一，即编码蛋白Keratin 17的基因在低转移性肿瘤中比在高转移性肿瘤中表达更强。Weissman说：“当我们敲低或过度表达角蛋白17时，我们发现该基因实际上在控制肿瘤的侵袭性。”

以这种方式识别与转移相关的基因，可以帮助研究人员回答有关肿瘤如何进化和适应的问题。“这是一种观察肿瘤行为和进化的全新方法。我们认为它可以应用于癌症生物学中的许多不同问题。”

来自哪里，又去向哪里？

Weissman研究团队的这一CRISPR方法还允许研究人员更详细地追踪转移细胞在体内的位置以及时间。例如，一个植入的癌细胞的子代进行了五次转移，每次都从左肺扩散到其他组织，例如右肺和肝。其他细胞跳到另一个区域，然后从那里再次转移。

这些运动可以在系统发育树中清晰地映射（见上图），其中每种颜色代表体内的不同位置。五颜六色的树显示出高度转移的表型，其中细胞的后代在不同组织之间跳跃了许多次。一种颜色的树表示转移较少的细胞。

通过这种方式绘制肿瘤进程图，Weissman和他的团队提出了转移机理的一些有趣的观察。例如，一些克隆以教科书的方式播种，从它们开始的左肺传播到身体的不同区域。其他的则更不规则地播种，先移至其他组织，然后再从那里转移。

作者认为，这样的组织，即位于肺之间的纵隔淋巴组织（mediastinal lymph tissue），似乎是各种各样的枢纽。“它是将癌细胞与所有肥沃的土地连接起来的路站，然后它们可以去殖民。”

从治疗上说，这样的转移“枢纽”的发现可能非常有用：“如果将癌症疗法集中在那些地方，那么就可以放慢转移速度或从一开始就预防转移。”

未来，研究人员希望超越单纯观察细胞，并开始预测其行为的范围。“这就像牛顿力学一样，如果知道球的速度和位置，以及所有作用在球上的力，就可以弄清楚在将来的任何时候球将向何处去。” “我们希望对细胞做同样的事情。”

研究人员认为，实时跟踪单个细胞的谱系也能用于其它领域，Matthew Jones说：“我认为这将为我们所认识的生物学上可测量的量开辟一个全新的维度。总的来说，这对这个领域来说真的很酷，因为我们正在重新定义不可见的和可见的。”

（生物通）

原文检索：

http://dx.doi.org/10.1126/science.abc1944

Single-cell lineages reveal the rates, routes, and drivers of metastasis in cancer xenografts