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一种检测单细胞mRNA动态变化的新方法:scNT-seq
【字体: 大 中 小 】 时间:2021年04月12日 来源:creative biogene
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为了克服这些限制,美国宾夕法尼亚大学吴浩实验室开发了单细胞代谢标记新RNA标记测序(scNT-seq),这是一种高通量、基于UMI的scRNA-seq方法,用于检测单细胞mRNA的动态变化。
在细胞命运转化和响应外界信号的过程中,细胞类型特异性基因表达会发生变化,RNA水平的动态变化受到RNA转录、加工和降解相互作用的调控。在具有多种细胞类型的复杂组织和系统中,准确判断这些mRNA在单细胞水平上的动态变化对于理解基因表达的调控非常重要。
单细胞RNA测序(scRNA-seq)的最新进展导致了对细胞类型和状态的异质性的更完整的理解。然而,传统的单细胞转录组测序技术可以揭示不同细胞类型的稳定转录组,但不能准确区分特定时间内新生成和存在的mRNA。通常用于在同一转录组中区分新旧RNA的方法依赖于利用外源性核苷类似物4-硫脲(4sU)和生化富集标记RNA的RNA代谢标记。但它们需要充足的起始材料,并对铀浓缩正常化构成挑战。近年来,研究人员开发了几种方法将4sU化学转化为胞嘧啶类似物,产生尿嘧啶-胞嘧啶取代物,在反转录后标记新转录的rna。这些化学方法允许直接测量细胞rna的时间信息,而不需要生化富集。然而,它们成本高、耗时长,缺乏独特的分子标识符(UMIs),从而阻碍了对新转录水平的精确定量。
为了克服这些限制,美国宾夕法尼亚大学吴浩实验室开发了一种高通量、基于umi的scna -seq方法——单细胞代谢标记新RNA标记测序(single cell metabolically labeled new RNA tagging sequencing, scNT-seq)来检测单细胞mRNA的动态变化。该方法创新地将mRNA的代谢标记、基于液滴微流的高通量单细胞转录组分析技术和化学诱导的4sU重编码到胞嘧啶模拟物中,同时测量来自同一细胞的新和旧转录组。在数据分析方面,为了在单细胞水平上更准确地分析新生成mRNA的比例,笔者构建了基于unique molecular identifiers (UMIs)的统计模型。相关研究发表在《自然方法》(Nature Methods)网站上,题为“大规模并行和时间分辨的单细胞scNT-seq RNA测序”。
scNT-seq的具体工艺流程如下:首先,对细胞进行4sU代谢标记。在纳米级液滴中,用条形码寡聚(dT)底漆包覆的微球共封装单个细胞,并在聚在一起的条形码微球上进行一锅4sU化学转换。然后进行逆转录、cDNA扩增、标记和引物PCR。最后,使用基于umi的统计模型分析转录本内的T-to-C替换,并推断新的转录本分数。
图1所示。scNT-seq的概述。(秋问,et al。, 2020)
利用这项技术,研究人员分析了小鼠神经元快速激活过程中的单细胞基因调控网络,并预测了细胞状态变化的轨迹。他们进一步研究了不同胚胎干细胞状态转变过程中mRNA动态变化的调控机制。将scNT-seq与遗传扰动整合,发现DNA甲基胞嘧啶双加氧酶是进入双细胞胚胎(2C)样细胞状态的表观遗传屏障。
总的来说,scNT-seq是一种可以在单细胞水平上准确量化新转录本的新技术。与现有的单细胞代谢标记分析方法相比,该新技术具有准确性高、通量高、成本低等优点。此外,用4sU和6-硫鸟嘌呤对细胞进行双重标记,然后再用scNT-seq,可以在单个细胞中进行两次独立的转录组记录,使时序实验设计能够解开复杂的RNA调控机制,并在较长时间内预测过去和未来的细胞状态。因此,高通量时间分辨的单细胞转录组学为研究动态生物系统提供了一种广泛适用的策略。
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