CRISPR辅助检测活细胞RNA结合蛋白的新方法

　　最近，由香港大学（CITYU）生物医学科学家领导的研究已经开发了CRISPR辅助RNA蛋白相互作用检测方法（CARPID），它利用CRISPR-CASRX的RNA靶向和接近标记来识别特定的长非编码RNAs（LNCRNs）在天然细胞背景中的结合蛋白。

　　

虽然科学家尚未完全了解RNA分子的多样性，但他们认为，与这些RNA分子结合的RNA结合蛋白可能与多种疾病的发生直接相关。最近，由香港城市大学(CityU)的生物医学科学家主导的研究开发了CRISPR-assisted RNA-protein interaction detection method (CARPID)，该方法利用基于crispr - casrx的RNA靶向和接近标记，来识别特定长链非编码RNA (lncRNAs)在原生细胞环境中的结合蛋白。这种新方法可应用于多种类型的细胞研究，如识别癌症生物标志物和检测治疗各种病毒性疾病的潜在药物靶点。这项研究发表在国际期刊《自然方法》上，题为“CRISPR辅助检测活细胞中的rna -蛋白质相互作用”。

分子生物学的核心原理是DNA被转录成RNA，而RNA最终被翻译成蛋白质。但事实上，只有大约2%的RNA可以编码蛋白质，而其余98%的RNA分子被称为非编码RNA (ncRNAs)，由于其神秘的功能，被视为“暗物质”。近年来，科学家们开始努力揭示RNA的真正功能，特别是长非编码RNA (lncRNAs，定义为长度超过200个核苷酸的非编码RNA))。lncrna作为调控基因表达的重要细胞成分被广泛接受，也是最有趣的rna之一。与RNA结合蛋白(rbp)的相互作用决定了RNA的功能和命运。尽管它们很重要，但在阐明活细胞中lncrna -蛋白相互作用方面存在明显的技术局限性。

为了规避现有方法的局限性，并检测活细胞中的RBPs，研究人员开发了一种称为CARPID的方法。受到利用CRISPR-dead Cas9 (dCas9)引导生物素连接酶到特定基因组位点的策略的启发，他们使用无核酸酶活性的紧凑rna靶向型VI-D CRISPR单效应系统dCasRx用于特定的lncRNA靶向。这种dCasRx效应蛋白能够将引导RNA (gRNA)阵列加工成两个或多个组成gRNA，而不需要切割靶向RNA转录本。CARPID可以敏感地检测任意长度或浓度的rna结合蛋白，而大多数其他方法只能应用于非常长的非编码rna。

图1所示。CARPID工作流方案。

CARPID由两部分组成:导航和接近生物素标记。首先，该团队使用CRISPR/CasRx系统进行导航，使CARPID组件(包括一种称为BASU的“标记工具”)能够接近目标RNA。研究人员将dCasRx与工程生物素连接酶BASU融合，然后是自切割的T2A肽和增强绿色荧光蛋白(eGFP)，以监测它们在活细胞中的表达。

为了测试CARPID的特异性，研究小组将其应用于三种不同的lncRNAs上，即DANCR、XIST和MALAT1。三种亚细胞分布部分相同的lncrna之间的CARPID结果比较，几乎没有重叠，说明CARPID方法对于不同长度和表达水平的lncrna在不同亚细胞定位的高特异性和适用性。

图2。不同lncrna间CARPID结果的比较。

CARPID可以实现高特异性，因为CRISPR导航非常准确。我们甚至可以得到非常准确的信息，即RNA结合蛋白的具体位置，”严博士解释说。此外，研究人员在过表达BASU-dCasRx和gRNAs的细胞中没有观察到基因表达的显著改变，证实CARPID不会干扰转染细胞的生理功能。借助CARPID技术，研究人员在不同的时间点检测同一RNA靶标，可以得到动态结果。

研究人员相信CARPID有广泛的应用，包括检测病毒RNA结合蛋白。例如，SARS-CoV-2是一种导致COVID-19的RNA病毒。一旦病毒进入宿主细胞，研究人员可以使用CARPID技术检测病毒在其生命周期中招募的特定细胞蛋白。如果结合蛋白被移除，研究人员可以抑制病毒的复制，相关信息可能帮助研究人员识别潜在的抗病毒药物靶点。

此外，许多lncrna也可以作为癌症的诊断生物标志物，因为它们在癌细胞中的水平与正常细胞相比非常高。CARPID还可以用于检测癌细胞中这些lncrna结合蛋白，这可能有助于发现致瘤机制和癌症诊断或治疗的潜在蛋白靶点。然而，CARPID还有改进的空间，例如，基于生物素标记的下拉仍然不可避免。一些技术，如XRNAX21、PTex23和OOPS22，利用物理化学特性来实现隔离和避免亲和捕获。但是这些方法不允许识别单个rna -蛋白质对。因此，CARPID和这些方法在研究RBP-lncRNA相互作用方面可以互补。