Nature子刊：单细胞CRISPR技术解读染色质可及性在癌症中的作用

　　研究人员开发了CRISPR-sciATAC，这是一个新的综合性基因筛选平台，可以在全基因组范围内联合捕获CRISPR基因扰动和单细胞染色质可及性。这一新方法利用基因编辑系统CRISPR的可编程性，将几乎所有与染色质相关的基因并行剔除，为研究人员深入了解DNA可及性在癌症和涉及染色质的罕见疾病中的作用。

　　

在今天发表在《自然生物技术》上的一篇科学界的新资源中，纽约基因组中心（NYGC）和纽约大学（NYU）的Neville Sanjana博士实验室的研究人员开发了CRISPR sciATAC，一个新的整合遗传筛选平台，联合捕获全基因组CRISPR基因扰动和单细胞染色质可及性。利用这项技术，他们分析了基因组组织的变化，并创建了一个大规模图谱，说明单个染色质改变酶的缺失如何影响人类基因组。新方法利用基因编辑系统CRISPR的可编程性，并行剔除几乎所有与染色质相关的基因，为研究人员提供了对DNA可及性在癌症和涉及染色质的罕见疾病中的作用的更深入的见解。

单细胞技术的最新进展使科学家能够分析染色质，即驻留在单个细胞细胞核内的DNA和蛋白质的复合体。染色质通常被称为基因组的“看门人”，因为它的蛋白质起着DNA的包装元素的作用，或者促进或拒绝接触DNA。这控制着细胞中的基因表达过程，例如打开或关闭特定的基因。染色质格局的变化与人类的各种特征和疾病有关，其中最显著的是癌症。

在CRISPR sciATAC的初步演示中，Sanjana实验室团队设计了一个CRISPR文库，针对20个染色质修饰基因，这些基因通常在不同的癌症中发生突变，包括乳腺癌、结肠癌、肺癌和脑癌。其中许多酶起到肿瘤抑制作用，它们的缺失导致染色质可及性的整体变化。例如，研究小组发现，编码组蛋白甲基转移酶的基因EZH2的缺失导致了几个先前沉默的发育基因的基因表达增加。

“CRISPR sciATAC的规模使得这个数据集非常独特。在这里，在一个统一的遗传背景下，我们有可访问性数据捕捉每个染色质相关基因的影响。纽约基因组中心和纽约大学桑贾纳实验室的博士后Noa Liscovitch Brauer博士说：“这提供了每个基因之间的详细图谱，以及它的缺失如何影响单细胞分辨率的基因组组织。”，研究小组瞄准了100多个与染色质相关的基因，并开发了一个“染色质图谱”，该图谱描绘了这些蛋白质丢失后基因组的变化。图谱显示，17个染色质重塑复合物中的不同亚基对基因组可及性有不同的影响。令人惊讶的是，几乎所有这些复合物都有亚单位，缺失触发了可接近性的增加，而其他亚单位的作用则相反。总的来说，转录因子结合位点是基因组中重要的功能元件，其最大的破坏发生在富含AT的相互作用域蛋白1A（ARID1A）缺失后，后者是BAF复合体的一个成员。据估计，每5种癌症中就有1种涉及BAF复合蛋白的突变。

除了CRISPR sciATAC方法外，研究小组还开发了一套计算方法来绘制核小体的动态运动，核小体是DNA包裹的蛋白质簇。当有更多的核小体时，DNA被紧紧地缠绕着，很少与转录因子结合。这正是研究小组在参与细胞增殖的特定转录因子结合位点发现的。当靶向不同的染色质修饰酶时，这些相同的位点经历了核小体间距的扩大，这表明了核小体在基因组特定位点定位的动力学。CRISPR-sciATAC方法使研究小组能够系统地探索多种染色质修饰酶和转录因子结合位点的基因组可塑性。

“我们真正致力于使CRISPR-sciATAC成为一种可获得的技术——我们希望它成为任何实验室都能做到的事情。纽约基因组中心和纽约大学Sanjana实验室的前博士后Antonino Montalbano博士说：“我们在内部生产了大多数关键酶，并使用了简单的单细胞分离方法，不需要微流体或单细胞试剂盒。”，研究人员使用人类和小鼠细胞的混合物来创建一个标记/识别过程，使他们能够分裂和编码细胞核，并捕获CRISPR靶向所需的单导向rna。这项工作建立在华盛顿大学Jay Shendure博士和其他研究小组开发新的单细胞基因组学方法之前的单细胞组合索引ATAC-seq（sciATAC-seq）工作的基础上。CRISPR sciATAC还使用了一种独特的，易于纯化的转座酶是在NYGC的创新技术实验室开发的。一个关键的技术障碍是优化实验条件，以同时捕获CRISPR导向RNA和基因组片段进行可接近性分析，同时保持每个细胞的核膜完整。

“整合染色质该研究的资深作者、纽约大学生物学助理教授、纽约大学格罗斯曼医学院神经科学和生理学助理教授、纽约GC核心教员Sanjana博士说：“在全基因组CRISPR屏幕上进行无障碍分析为我们理解基因调控提供了一个新的视角。”通过CRISPR sciATAC，我们可以全面了解特定染色质修饰酶和复合物如何改变可及性并协调控制基因表达的相互作用。染色质决定了基因表达的阶段，在这里我们可以快速测量不同突变对染色质的影响。我们希望该图谱将成为社区广泛有用的资源，CRISPR sciATAC将用于在其他生物系统和疾病背景下产生类似图谱。”

Journal Reference:

1. Noa Liscovitch-Brauer, Antonino Montalbano, Jiale Deng, Alejandro Méndez-Mancilla, Hans-Hermann Wessels, Nicholas G. Moss, Chia-Yu Kung, Akash Sookdeo, Xinyi Guo, Evan Geller, Suma Jaini, Peter Smibert, Neville E. Sanjana. Profiling the genetic determinants of chromatin accessibility with scalable single-cell CRISPR screens. Nature Biotechnology, 2021; DOI: 10.1038/s41587-021-00902-x