蛋白酶作为饲料添加剂在家禽养殖中具有广阔的应用前景

　　蛋白酶被列为三大工业酶集团之一，约占全球酶销售总量的60%，其中40%属于细菌蛋白酶。细菌丝氨酸蛋白酶具有广泛的底物特异性和对各种条件的高抗性，这使其在生物技术方面的应用，特别是作为家禽和动物的生物添加剂。

　　

   

   

图:枯草杆菌素样蛋白酶的蛋白水解活性对重组酵母生长动力学的依赖

资料来源:喀山联邦大学

蛋白酶是用于提高饲料添加剂效率的最具创新性的产品之一。由于其水解特性，提高了对氨基酸的吸收，从而降低了蛋白质含量和饲料成本。短小芽孢杆菌3-19的枯草菌素样蛋白酶(AprBp)是一种很有前景的工业应用的饲料添加剂。然而，为了获得高产量的酶，需要建立一个高效的表达系统。

本研究旨在获得短小杆菌3-19蛋白酶基因在毕赤酵母表达系统中的稳定表达，并评价酶活性与载体类型和信号肽选择的相关性。为了使优化后的蛋白酶基因在甲基营养酵母细胞中稳定表达，本研究选择了载体pPINK-HC和pPINK-LC。重组蛋白酶的胞外分泌使用一套有效的信号肽。α交配因子的前序列多次导致重组蛋白分泌的增加。另一方面，杀菌剂和溶菌酶信号肽的序列以前没有被用于细菌蛋白酶的表达。基于pPINK-LC载体构建的转化子在孵育第3天检测到，比基于pPINK-HC载体构建的转化子在孵育第7天检测到的转化效率更高。pPINK-LC载体在第10天的转化效率平均为1.3×103转化子/μg DNA，而pPINK-HC载体的转化子/μg DNA为1.03×103。菌落PCR结果表明，所有筛选到的转化菌落均含有整合到酵母基因组中的枯草杆菌素样蛋白酶基因。研究表明，培养时间对巴氏酵母蛋白酶的合成有影响，并观察到酶的最大活性。酵母菌株与构造基于low-copy向量pPINK-LC显示较高的蛋白酶活动(U /毫升)的水解azocasein(2.63±0.16杀手信号肽(SP), 2.49±0.08αpresequence交配因子,对溶菌酶2.19±0.11 SP)比菌株构建基于pPINK-HC向量(1.86±0.09杀手SP,α-交配因子前序列为2.21±0.07，溶菌酶SP为1.31±0.11)。pPINK-LC-killer- aprbp(5.75±0.08 U/ml)和pPINK-LC-α-mat菌株的蛋白酶活性最高。因子- aprbp(4.33±0.07 U/ml)构建。本研究表明，重组巴氏杆菌枯草菌样蛋白酶具有蛋白水解活性，其水解活性取决于培养时间和信号肽和载体的选择。利用异体酵母表达系统生产细菌蛋白酶，为新型饲料添加剂的开发提供了广阔的前景。

蛋白酶被列为三大工业酶集团之一，约占全球酶销售总量的60%，其中40%属于细菌蛋白酶。细菌丝氨酸蛋白酶具有广泛的底物特异性和对各种条件的高抗性，这使其在生物技术方面的应用，特别是作为家禽和动物的生物添加剂。此外，在饲料中添加蛋白酶可以提高动物对氨基酸的吸收，节省购买合成氨基酸的资金。研究还表明，使用蛋白酶作为饲料添加剂增加了氮的生物有效性，从而降低了土壤中的氨污染水平。蛋白酶促进了其他酶的作用，提高了饲料的成本效益，促进了肉鸡肠道有益菌群的生长。

如今，俄罗斯使用的是来自外国制造商的有限数量的商业蛋白酶。俄罗斯市场的主要代表是进口饲料添加剂CIBENZA DP100 (NOVUS(88.1%)，美国)，RONOZYME?ProAct (DSM(9.4%)，瑞士)，AxtraPRO TPT(杜邦(2.4%)，德国)。重组菌株由含有枯草菌素样杆菌蛋白酶(aprBp)基因的巴氏杆菌菌株和三种不同的信号肽(α-交配因子、杀伤蛋白和溶菌酶)组成。进一步从酵母培养液中表达和纯化蛋白酶，研究其生化特性和酶学特性，将有助于评价重组酶的生物技术前景。

DOI

10.1007 / s12668 - 021 - 00899 - 2

文章标题

Heterologous Expression of Bacillus pumilus 3–19 Protease in Pichia pastoris and Its Potential Use as a Feed Additive in Poultry Farming