Science Advances：即使是好的基因编辑也会变坏

　　莱斯大学(Rice University)的一个实验室正在牵头揭示CRISPR/Cas9基因编辑的潜在威胁。

　　

   

   

图片:莱斯大学的研究人员正在努力揭示CRISPR-Cas9基因编辑的潜在威胁。左起分别是：Julie Park, Lavanya Saxena, Mingming Cao and Gang Bao.

莱斯大学的一个实验室正在努力揭示基于CRISPR-Cas9(诺贝尔奖得主)基因编辑技术的治疗方法的有效性和安全性的潜在威胁，即使该技术似乎按计划发挥作用。

莱斯大学生物工程师Gang Bao和他的团队在《科学进展》杂志上发表的一篇论文中指出，虽然DNA脱靶编辑长期以来一直是一个令人担忧的问题，但伴随脱靶编辑的看不见的变化也需要被认识到——并量化。

他指出，2018年《自然·生物技术》的一篇论文表明存在大量的缺失。他说:“那时我们开始研究如何量化它们，因为有了用于治疗镰状细胞病的CRISPR-Cas9系统。”

Gang Bao一直在进行CRISPR-Cas9作为治疗镰状细胞病工具的研究，这一探索使他和他的同事们离治愈镰状细胞病越来越近。现在，研究人员担心，由于基因编辑导致的大量缺失或其他未被发现的变化可能在干细胞分裂和分化过程中持续存在，从而对健康产生长期影响。

Bao教授说:“我们还没有很好地理解为什么Cas9切割位点的几千个碱基DNA会丢失，而DNA双链断裂仍然可以有效地重新连接。这是第一个问题，我们有一些假设。第二个问题是，生物后果是什么? 大的缺失(LDs)可以到达邻近的基因，并破坏目标基因和邻近基因的表达。目前还不清楚LD是否会导致截断蛋白的表达。“

他说:“也可能有蛋白质错误折叠，或蛋白质由于大量插入而具有额外的结构域。各种各样的事情都可能发生，细胞可能死亡或功能异常。”

他的实验室开发了一种程序，使用单分子实时(SMRT)测序与双唯一分子标识符(UMI)，发现和量化无意的LD，以及Cas9靶切位点上的大插入和局部染色体重排(伴随小插入/删除(INDELs))。

Bao教授说:“为了量化大型基因修饰，我们需要进行远程PCR，但这可能会在DNA扩增过程中引起人工干扰。所以我们使用18个碱基的UI作为一种条形码。”

他说:“我们将它们添加到我们想要扩增的DNA分子中，以识别特定的DNA分子，这是一种减少或消除远程PCR产生的假象的方法。我们还开发了一个生物信息学管道来分析SMRT测序数据，并对ld和大型插入进行量化。”

Bao实验室的工具被称为LongAmp-seq(用于长扩增子测序)，可以精确地量化小的INDELs和大的ld。与SMRT-seq不同，SMRT-seq需要使用通常只在核心设施中可用的长读测序器，LongAmp-seq可以使用短读测序器执行。

为了测试这一策略，由Rice校友Julie Park领导的实验室团队，使用化脓性链球菌Cas9编辑镰状细胞病患者造血干细胞和祖细胞(HSPC)中的β -珠蛋白(HBB)， γ -珠蛋白(HBG)和b细胞淋巴瘤/白血病11A (BCL11A)增强子，以及原代t细胞中的PD-1基因。

他们发现高达几千个碱基的大量缺失在HSPCs中频繁发生:HBB基因中高达35.4%，HBG基因中高达14.3%，BCL11A基因中高达15.2%，t细胞中PD-1基因中也高达15.2%。

由于Bao实验室测试的两种特定的CRISPR导向正在用于治疗镰状细胞病的临床试验，他说，确定由cas9诱导的双链断裂引起的大型基因修饰的生物学后果很重要。

Bao教授说，赖斯大学的研究小组目前正在下游分析信使RNA长时间缺失的后果，信使RNA是一种携带核糖体编码以制造蛋白质的介质。“然后我们将继续研究蛋白质水平，我们想知道，在基因编辑的HSPCs移植到小鼠和患者后，这些大规模的删除和插入是否还会持续。”

文章标题

Comprehensive analysis and accurate quantification of unintended large gene modifications induced by CRISPR-Cas9 gene editing