翻译组方法技术突破：PETEOS可以帮助我们研究细胞蛋白质

　　pep-tRNAs—nascent polypeptides在蛋白质合成过程中短暂出现。通过有机萃取和二氧化硅吸附富集技术的开发，研究这些中间产物并更好地了解它们在基因调控等过程中的作用的潜力大大增强。这种方法由东京工业大学的科学家开发，可以大规模收集、处理和鉴定pep-tRNA多肽部分。

　　

   

   

分子生物学的进展已经揭示了核糖体内的pep-tRNAs—nascent polypeptides，这种多肽共价连接到转移RNA上，参与了无数的细胞功能，包括基因表达。所有蛋白质在某种程度上都以pep-tRNAs的形式存在，研究这些翻译中间体至关重要，因为它们同时具有RNA和蛋白质的特性，可以帮助研究人员更好地理解翻译的细节。根据刺激和/或应力，平动调节非常迅速，跨越起始、延伸和延伸暂停。因此，要获得对翻译过程的更深入的了解，需要一种合适的方法来大量处理pep-tRNAs。这些细微差别促进了研究细胞转译的分子工具的发展。

目前，用于研究细胞翻译的两种主要方法利用了截然不同的策略。第一种是核糖体分析，这是一种强大的深度测序技术，通过靶向RNase消化产生的核糖体保护的mRNA片段来监测翻译。不幸的是，这种方法本质上无法捕获pep-tRNAs，耗时、昂贵且数据密集。另一种方法依赖于液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)的蛋白质组学，并需要使用不寻常的氨基酸来标记多肽。然而，这种蛋白质组学方法是时间密集型的，而且最重要的是，不能捕获细胞的翻译延伸状态，因为pep-tRNAs不是直接靶向的。

为了克服“pep-tRNA-ome”技术的这些限制，由Hideki Taguchi教授领导的东京工业大学(Tokyo Tech)的科学家团队开发了PETEOS。关于他们工作的主要优势，Taguchi教授解释说:“这种非标记方法是独特的，因为它专门富集和快速捕获pep-tRNAs，同时仍然补充了传统的翻译组分析平台。” 

PETEOS有四个步骤。首先，用有机溶剂萃取富集RNA，然后在硅胶柱上分离。接下来，利用高pH值和温度将分离出的pep-tRNA中的目标多肽与其核糖核苷酸分离。然后，将释放出来的多肽进行酶解和裂解。最后，这些多肽通过鸟枪LC-MS/MS蛋白质组学进行鉴定。

作为一个概念验证，我们能够用PETEOS鉴定出近800个大肠杆菌蛋白质，这些蛋白质来自于pep-tRNA。重要的是，这些蛋白质在N端富集，这强调了该方法确实在翻译过程中捕获了中间的pep-tRNA池。"当被问及他们新方法的意义时，Taguchi教授说。

该团队还证明了，当大肠杆菌细胞受到热冲击和抗生素处理时，PETEOS能够捕获新生体的 "截图"，在任何特定时间存在的新生pep-tRNAs池。PETEOS在捕捉热应激下急性蛋白质表达的能力和接触不同抗生素后新生组的重新排列方面优于传统方法。

此外，PETEOS也确实有一些局限性，包括难以使用LC-MS/MS分析低丰度的pep-tRNAs，由于酸性苯酚/氯仿步骤，定量能力有限，没有密码子级分辨率，以及难以捕获生长多肽的C端。然而，传统方法也存在这些问题，可以通过提高这一过程的C端肽富集效率来克服。

该团队认为，未来可以进一步优化程序。Taguchi教授总结道:“尽管存在局限性，但我们相信PETEOS具有潜力，因为它可以实现当前翻译组方法无法实现的分析。最重要的是，它可以应用于任何生物体! 随着这一领域的更多研究，我们将加深对蛋白质合成的理解。”

文章标题

A method to enrich polypeptidyl-tRNAs to capture snapshots of translation in the cell