DART VADAR利用酶的力量制造更好的RNA药物

　　基因治疗被誉为医学的新前沿，但目前的技术仍有许多局限性;其中，如何将治疗基因传递到特定的细胞，并仅在正确的环境下激活它们。一个团队创造了一种新的基于rna的工具，名为DART VADAR，可以让基因编辑走出这些问题的“阴暗面”，走向光明。使用一种天然酶的工程形式，他们的传感器可以自动感知触发分子的存在，并启动细胞内有效负载基因的翻译。这一进展扩大了可以用基于rna的治疗方法治疗的疾病的范围，并使开发针对各种疾病的高度特异性治疗成为可能。

　　

自COVID大流行开始以来，全球已接种了120多亿剂mRNA疫苗，挽救了数百万人的生命。但到目前为止，其他疾病的基于rna的疗法被证明更具挑战性。由mRNA疫苗引起的全身免疫反应对于抵抗入侵的病原体是非常棒的，但许多其他情况只影响单个器官或细胞类型。改造RNA分子，使其仅在合适的条件下激活其治疗有效载荷，是下一代“智能”RNA疗法的关键。

据《自然通讯》杂志报道，哈佛大学威斯研究所和麻省理工学院的研究人员创造的一种新系统可能有助于释放这一潜力。该团队在Wyss核心教员Jim Collins博士的实验室工作，开发了一种新型的RNA感知和反应电路，他们称之为通过ADAR检测和放大RNA触发，或DART VADAR。利用编辑人体内RNA的酶，DART VADAR允许研究人员轻松设计电路，触发传递的遗传有效载荷的翻译，以响应疾病和/或细胞类型的特定分子标记的存在。这种能力扩大了以rna为基础的治疗方法可以解决的疾病的范围，并使开发针对各种疾病的高度特异性治疗成为可能。

Collins说:“我特别兴奋的是，我们的DART VADAR系统是一种临床相关的、紧凑的基于rna的电路，能够以高度可编程的方式指导治疗特定细胞类型和特定状态的细胞，从而最大限度地减少脱靶效应。”Collins也是麻省理工学院医学工程与科学的Termeer教授。

从触发到转化再到治疗

柯林斯实验室长期以来一直对寻找控制细胞中rna翻译的方法感兴趣，并开发了几种方法，包括etoeholding，这些方法只允许它们在特定的“触发”分子存在的情况下启动翻译。但是，为每一个新的触发物设计一个新的分子结构的过程既繁琐又复杂。“我们的技术源于这样一个想法，即我们可以将响应性RNA传感器的元素(传感、驱动等)解耦，因此为新目标设计电路要容易得多。理想情况下，我们希望能够在每次都不修改传感器元件的情况下改变有效载荷，”共同第一作者Rapha?l加耶博士说，他是威斯研究所的研究科学家。

DART VADAR所围绕的物质被称为作用于RNA的腺苷脱氨酶，或adar。adar是一种结合双链RNA (dsRNA)分子并进行特定碱基编辑的酶，将不匹配的腺苷(a)分子转化为肌苷(I)。这种变化破坏了dsRNA结构的稳定，并被认为与细胞对不同病毒的反应有关，其中许多病毒携带其遗传物质为RNA。

研究人员推断，他们可以利用adar天然的dsrna编辑能力来创建一种新型的响应式RNA传感器。因此，他们设计了一个包含多个模块元件的单链RNA电路:

• 与细胞中相关RNA互补的序列

• RNA链中间尿嘧啶-腺苷-鸟嘌呤(UAG)的“停止”密码子序列

• 编码荧光绿色蛋白作为可观察信号分子的序列

UAG密码子序列可以阻止在它之后编码的任何基因，如绿色荧光蛋白，被翻译，因为UAG是核糖体的自然信号，它应该停止翻译过程并从RNA链上脱落。然而，如果该电路与细胞中互补的目标RNA链结合，它就成为双链RNA分子。该团队设计了他们的电路，使UAG序列的A与目标链中的胞嘧啶(C)“不匹配”，而不是它的合法伙伴u。这种不匹配基本上释放了被ADAR发现的A，并将其转换为I，由此产生的UIG序列不再是一个“停止”密码子，允许翻译发生。因此，绿色荧光蛋白产生，信号传感器电路已经找到并结合到它的目标。

adar在神经元中自然存在高浓度，但在其他细胞中含量很低，研究小组发现，虽然他们基于adar的传感器工作，但其活性很低。为了确保传感器可以在不同类型的细胞中工作，他们将ADAR基因序列添加到传感器中。现在，由细胞中自然存在的ADAR激活传感器可以刺激更多ADAR的产生，创建一个正反馈循环，放大传感器的活动。他们在体外实验中证实了这一点，观察到接受含有adar的DART VADAR传感器的细胞显示荧光绿色蛋白水平显著增加。

“这个传感器真正令人兴奋的是，绿色蛋白质信号序列可以很容易地替换为任何治疗基因的序列，你想要表达对细胞中存在的触发RNA的反应。因此，这种传感器不仅可以检测目标，还可以在不需要用户输入的情况下自动对它们做出反应，在细胞水平上自动递送治疗有效载荷，”麻省理工学院博士后Shiva Razavi博士说。

高灵敏度传感器

虽然该团队对他们的第一个版本的DART VADAR工作感到兴奋，但他们意识到，如果要将其用作治疗方法，他们必须进行一些修改。

“虽然通过我们的传感器表达自然发生的ADAR将a -to- i编辑率从约3%提高到约30%，但这在现实世界中仍然没有发挥作用。内源性ADAR不足以产生一致的结果，而且太大，不适合临床批准的运载工具，如AAV[腺相关病毒]。在翻译潜力方面，重要的是要确保你在实验室里做的任何事情有一天都能现实地变成产品，”麻省理工学院博士后研究员、联合第一作者凯瑟琳·伊利亚博士说。

为了解决这些限制，该团队利用了一种经过工程改造的ADAR变体，该变体被截断为只包含其活跃的RNA编辑区域，并添加了两个短区域，可以与称为MS2的“发夹”RNA结构结合，他们将其插入UAG密码子侧翼的传感器序列中。他们将这种嵌合蛋白命名为MCP-ADAR，它比天然存在的ADAR小得多，并且与脱靶分子结合的可能性也降低了。他们还修改了RNA传感器中的ADAR基因，以便将其翻译成修改后的MCP-ADAR版本。现在，当一个传感器被细胞中自然产生的ADAR激活时，产生的MCP-ADAR可以通过MS2发夹与其他传感器结合，驱动更多MCP-ADAR的产生，并放大传感器的活性。

为了测试他们优化的DART VADAR系统及其工程酶的性能，该团队决定看看它是否能检测到人类p53肿瘤中的单碱基突变

抑制基因，已知会导致几种癌症。他们设计了一种DART VADAR传感器来检测p53突变基因，并将其与表达该基因正常或突变版本的质粒一起导入人类细胞中。他们发现，含有该基因突变版本的细胞在传感器中也显示出5倍的报告基因激活，这表明传感器确实以高特异性记录了异常基因序列的存在。

接下来，他们测试了DART VADAR是否能够根据细胞状态的特定分子标记来区分处于不同发育阶段的健康细胞。他们使用了称为成肌细胞的小鼠细胞，成肌细胞是一种祖细胞，可以分化成多种细胞类型，包括肌管(变成肌肉)和成骨细胞(产生骨骼)。他们设计了DART VADAR传感器来检测两种细胞命运的RNA标记，刺激成肌细胞分化，然后将它们的传感器添加到细胞中。他们发现这两种传感器都在相应的细胞中强烈地产生了各自的有效载荷信号分子，这表明传感器可以检测到细胞状态和细胞类型的分子差异。

该团队指出，为了将DART VADAR应用于各种临床应用，在传感器开发过程中需要考虑靶点的其他方面，例如触发免疫反应的可能性。他们预计，最近在蛋白质结构预测方面的计算进展可以用于进一步细化最佳靶点的选择，以指导安全有效的DART VADAR传感器的设计。他们已经申请了一笔拨款，使用DART VADAR来探索干细胞向其他细胞类型的逐步分化，在未来可以用来用健康细胞替代患者的病变细胞。

“这个团队能够将现有的生物成分结合成一种全新的工程技术，有可能使各种疾病的治疗更快、更容易，这是合成生物学如何让世界变得更好的一个很好的例子。”Wyss的创始董事Don Ingber博士说，Ingber也是哈佛医学院和波士顿儿童医院的Judah Folkman血管生物学教授，Hansj?rg哈佛约翰·a·保尔森工程和应用科学学院的Wyss生物工程教授。

Nathaniel Tippens是该论文的另一位共同第一作者。其他作者包括Wyss研究所和麻省理工学院的Makoto Lalwani, Kehan Zhang和Jack Chen，麻省理工学院和Broad研究所的Jonathan Chen，以及麻省理工学院皮考尔研究所的Jose varga - asencio。这项工作得到了NIH拨款R01EB024591和5RC2DK120535-03以及Wyss生物启发工程研究所的支持。

Journal Reference:

1. Raphaël V. Gayet, Katherine Ilia, Shiva Razavi, Nathaniel D. Tippens, Makoto A. Lalwani, Kehan Zhang, Jack X. Chen, Jonathan C. Chen, Jose Vargas-Asencio, James J. Collins. Autocatalytic base editing for RNA-responsive translational control. Nature Communications, 2023; 14 (1) DOI: 10.1038/s41467-023-36851-z