基于CRISPR 先导编辑生成小鼠癌症突变模型

　　科学家们不确定与肿瘤发展相关的成千上万的基因突变是如何导致癌症的，因为没有简单的方法在动物模型中研究它们。麻省理工学院的研究人员现在已经开发出一种基于CRISPR的prime编辑方法，将个体癌症相关突变设计到小鼠模型中。这项技术可以帮助揭示未知的癌症突变的作用，并产生模型来帮助识别和测试新药。

　　

对癌症患者的基因组研究已经揭示了数千种与肿瘤发展有关的突变，但研究人员不确定这些突变中绝大多数是如何导致癌症的，因为在动物模型中没有简单的方法来研究它们。麻省理工学院的研究人员现在已经开发出一种方法，可以轻松地将特定的癌症相关突变设计到小鼠模型中，并使用基于CRISPR基因组编辑的方法在不同器官中生成几种不同的致癌Kras基因突变模型。

他们相信，他们的先导编辑方法可以帮助科学家开始了解许多未被探索的突变，并生成可用于帮助识别测试新药的模型。研究人员通过杰克逊实验室(Jackson Laboratory)的一个存储库，在小鼠的基因组中植入了“先导编辑系统”，他们希望其他实验室也能开始将这项技术用于自己的癌症突变研究。

“这是一种非常强大的工具，可以检查任何对完整动物感兴趣的突变的影响，而且只需要早期方法所需时间的一小部分，”麻省理工学院科赫综合癌症研究所的成员Tyler Jacks博士说。

Jacks是该团队在《Nature Biotechnology》上发表的论文的通讯作者之一。麻省理工学院生物学助理教授、科赫研究所成员Francisco Sánchez-Rivera博士和哈佛大学化学与化学生物学系教授、Broad研究所核心成员David Liu博士是该研究的共同通讯作者。

作者指出，癌症是由在疾病进展过程中积累的体细胞突变驱动的，这种突变可能在人类癌症中以数千种不同的组合出现。“驱动突变及其组合的精确性质可以深刻地影响癌症的发生、进展和对治疗的反应，将肿瘤基因型确定为疾病结局的关键决定因素。”研究小组继续说，基因工程小鼠模型(GEMMs)在阐明癌症驱动因素促进体内肿瘤发展和进展的机制方面已被证明是“无价的”。在这样的模型中测试抗癌药物是确定它们是否安全有效、足以进入人体临床试验的重要一步。

在过去的20年里，研究人员利用基因工程技术通过删除肿瘤抑制基因或激活促癌基因来创建小鼠模型。然而，这种方法是昂贵的，劳动密集型的，需要几个月甚至几年的时间来生产和分析具有单一癌症相关突变的小鼠。研究人员指出:“研究人员也可能需要几个月的时间来获得已建立的GEMMs ，并且通常需要费力的育种计划来组合多个感兴趣的等位基因，并为实验队列建立足够规模的群体。”

“一个研究生可以围绕建立一个突变模型建立整个博士学位，”共同第一作者Zack Ely博士说，他曾是麻省理工学院的研究生，现在是麻省理工学院的访问科学家。“使用传统模型，该领域需要几十年的时间才能赶上我们用癌症基因组图谱发现的所有突变。”

在2010年代中期，研究人员开始探索使用CRISPR基因组编辑使癌症突变更容易发生的可能性。其中一些工作是在Jacks的实验室里进行的，Sánchez-Rivera(当时还是麻省理工学院的研究生)和他的同事们表明，他们可以使用CRISPR快速、轻松地敲除肿瘤中经常丢失的基因。然而，尽管这种方法可以很容易地敲除基因，但它并不适合在基因中插入新的突变，因为它依赖于细胞的DNA修复机制，而这种机制往往会引入错误。研究小组指出:“基因组编辑技术的进步加速了功能遗传学研究，但大多数癌症突变模型的方法都依赖于通过非同源末端连接介导的Cas9介导的基因破坏，未能重现在人类癌症中观察到的许多遗传病变。”

受到Liu在Broad研究所实验室研究的启发，麻省理工学院的研究小组想要想出一种方法来进行更精确的基因编辑，使他们能够对致癌基因(驱动癌症的基因)或肿瘤抑制基因进行非常有针对性的突变。

2019年，Liu及其同事报告了一种新版本的CRISPR基因组编辑，称为prime编辑（先导编辑）。与使用Cas9酶在DNA中产生双链断裂的原始版本CRISPR不同，prime编辑使用修饰的Cas9缺口酶，该酶与逆转录酶融合在一起。这种融合酶只切割DNA螺旋的一条链，因此避免了在细胞修复DNA时引入可能导致错误的双链DNA断裂。

“prime编辑器使用Cas9缺口酶与逆转录酶偶联，与prime编辑指导RNA (pegRNAs)复合物，”科学家解释说。这些pegRNAs在逆转录酶模板(RTT)中编码感兴趣的突变，以实现高度精确和可编程的编辑。该团队表示:“因此，prime编辑提供了一种通用的方法来研究癌症驱动突变的全谱、它们的组合以及对靶向治疗产生耐药性的不断增长的继发突变目录。”

麻省理工学院的研究人员通过将prime编辑酶的基因植入小鼠的生殖细胞，设计了新的prime编辑GEMMS (PE GEMM)，这意味着它将存在于生物体的每个细胞中。他们说:“在小鼠种系中编码引物编辑机制也可以最大限度地减少由外源性递送基于cas9的融合蛋白诱导的急性或慢性抗肿瘤免疫反应的混淆。”编码的prime编辑酶允许细胞将RNA序列复制到DNA中，并将其整合到基因组中。然而，在被一种叫做Cre重组酶的特定蛋白质激活之前，这个prime编辑基因一直保持沉默。

由于prime编辑系统安装在小鼠基因组中，研究人员可以通过将Cre重组酶注射到他们想要表达癌症突变的组织中，以及指导Cas9缺口酶在细胞基因组中进行特定编辑的引导RNA，来启动肿瘤生长。RNA指南可以被设计成在特定基因中诱导单个DNA碱基的替换、缺失或添加，从而允许研究人员创造任何他们想要的癌症突变。

“与PE GEMMs的开发相结合，我们还开发了一系列DNA载体和工程pegRNAs (epegRNAs)，促进了来自这些小鼠的各种细胞系和类器官的高效先导编辑。调查人员解释说。

为了证明他们的技术的潜力，研究人员在Kras基因中设计了几种不同的突变，Kras基因导致了大约30%的人类癌症，包括几乎所有的胰腺腺癌。然而，并非所有的Kras突变都是相同的。许多Kras突变发生在被称为G12的位置，在那里发现了氨基酸甘氨酸。根据突变的不同，甘氨酸可以变成几种不同的氨基酸之一。

研究人员开发了肺癌中发现的四种不同类型的Kras突变模型:G12C、G12D、G12R和G12A。令他们惊讶的是，他们发现这些模型中产生的肿瘤具有非常不同的特征。例如，G12R突变产生较大的侵袭性肺肿瘤，而G12A肿瘤较小且进展较慢。他们说:“我们观察到不同的Kras突变在体内表现出不同的肿瘤启动潜力，这与之前比较胰腺中Kras^G12C和Kras^G12D的原位模型的研究一致。在肺部，我们发现Kras^G12A、Kras^G12D和Kras^G12R促进了有效但可变的肿瘤形成。”

更多地了解这些突变如何以不同的方式影响肿瘤的发展，可以帮助研究人员开发针对每种不同突变的药物。目前，只有两种FDA批准的靶向Kras突变的药物，它们都是针对G12C突变的，G12C突变约占肺癌中Kras突变的30%。

研究人员还利用他们的技术，在肿瘤抑制基因p53中制造了几种不同类型突变的胰腺类器官，他们现在正在开发这些突变的小鼠模型。此外，他们还在研究产生额外的Kras突变模型，以及其他有助于赋予Kras抑制剂耐药性的突变。

“让我们感到兴奋的一件事是研究包括驱动肿瘤发生的Kras突变在内的突变组合，以及与耐药性相关的突变，我们希望这不仅能让我们了解突变是否会导致耐药性，还能让我们了解耐药性肿瘤是什么样子的?”作者在他们的论文中进一步指出，“虽然我们专注于安装体细胞癌症驱动突变，但我们预计PE GEMMs可以用于更广泛的应用……我们相信这种方法将加速癌症相关突变和复杂基因组合的功能研究，这些研究是传统模型难以构建的。PE GEMMs可以提供快速的临床前途径，以补充旨在以精确治疗范例治疗癌症的基础和临床研究。”

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