《Nature》百万级快速基因组构建

　　英国剑桥医学研究委员会(MRC)分子生物学实验室的Julian Sale和Jason Chin的实验室创造了两种对大规模快速基因组构建至关重要的新工具。本文提出了一种利用BASIS快速拼接大碱基DNA的方法，以及利用CGS连续替换宿主DNA和外源DNA的方法。

　　

英国剑桥医学研究委员会(MRC)分子生物学实验室的Julian Sale和Jason Chin的实验室创造了两种对大规模快速基因组构建至关重要的新工具。

这些工具，BASIS(细菌人工染色体逐步插入合成)和CGS(连续基因组合成)，解决了创建基因组的两个最重要的问题:1)从更小的片段中快速组装出大量的DNA; 2)以可扩展的方式用合成DNA取代生物体的基因组DNA。

BASIS和CGS使同时构建多个完全合成的基因组成为可能。作者利用这些基因组将人类基因组中“无疤痕”的大部分片段组合在一起。这一技术进步可以促进基因组水平上的高通量实验和基因组文库的创建。

详细介绍这些方法的研究发表在《Nature》杂志上。

基因组的发展为定义基因组序列和它们编码的功能之间的关系以及创造具有新颖和有用功能的生物体提供了前所未有的机会。大肠杆菌是一个很有吸引力的宿主，它可以将大量DNA片段组装成片段，作为构建千兆酶级合成基因组的起点。但是，目前在大肠杆菌中组装DNA的方法只能完成一次，使用非常小的DNA片段，使用留下疤痕的位点特异性重组酶，或者需要在体外将DNA片段线性化并电穿孔。

本文提出了一种利用BASIS快速拼接大碱基DNA的方法，以及利用CGS连续替换宿主DNA和外源DNA的方法。

Sale和Chin实验室使用BASIS以高保真度从细菌人工染色体(BACs)中组装了1.1 Mb的人类21号染色体切片。这种人类DNA包括许多外显子、内含子、重复序列、G-四联体和长、短穿插核元素(LINEs和SINEs)。

然后，他们证明了含有大DNA的BASIS BACs为大肠杆菌的快速修饰和人类细胞中的表达提供了一个方便的平台。为此，他们纠正了合成的囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR) BAC，将其转染到人类细胞中，并证明了来自BAC的CFTR基因驱动了纠正的CFTR转录物的表达。

为了使CGS发挥作用，Sale和Chin实验室发现了一种不太容易在外源DNA和宿主基因组之间交叉的大肠杆菌菌株，他们用这种菌株连续插入100 kb的合成DNA片段。作者利用该菌株在短短10天内将来自5个片段的0.5 Mb DNA片段整合到大肠杆菌基因组中。他们相信，将CGS与快速寡核苷酸合成和片段体组装相结合，以及将具有不同合成基因组片段的菌株的单个基因组组装在一起的快速方法，将使他们能够在不到两个月的时间内从功能设计中创建整个大肠杆菌基因组。

使用BASIS和CGS创建的DNA可用于将大量表观DNA移动到人类，动物或植物细胞中，并在这些细胞中进行迭代重组，以将合成序列插入人工染色体或用合成序列替换染色体中的自然序列。

总之，快速组装超大规模DNA的能力和CGS的进步为快速和可扩展的基因组合成奠定了重要的基础。有了在细胞之间移动大DNA结构的新方法，这些技术使大肠杆菌更接近于成为构建千兆酶级合成基因组学的平台。

Continuous synthesis of E. coli genome sections and Mb-scale human DNA assembly