PNAS：反义疗法恢复人体细胞中特殊蛋白的生产

　　由麻省大学陈医学院的Joel D. Richter博士、Sneha Shah博士和Jonathan K. Watts博士以及RUSH大学医学中心的Elizabeth Berry-Kravis博士开发的一种反义疗法，可以恢复脆性X综合征患者细胞样本中FMRP蛋白的产生。

　　

由麻省大学陈医学院的Joel D. Richter博士、Sneha Shah博士和Jonathan K. Watts博士以及RUSH大学医学中心的Elizabeth Berry-Kravis博士开发的一种反义疗法，可以恢复脆性X综合征患者细胞样本中FMRP蛋白的产生。发表在《美国国家科学院院刊》(Proceedings of the National Academy of Sciences)上的这一突破之所以成为可能，是因为这项研究也提出了新的发现，即信使RNA (mRNA)的异常选择性剪接在脆性X综合征(fragile X syndrome)中起着主要作用，脆性X综合征是最常见的遗传性智力残疾形式，也是自闭症最常见的单基因病因。

“这一发现提供了真正的希望，减轻脆性X综合征的治疗可能是可能的，并且可以比我们曾经想象的更快地转化为临床，”Arthur F. Koskinas神经科学主席和分子医学教授Richter博士说。“这些发现是非常规的，不是我们所期望的。如果你做好基础科学，相信你的数据，并跟随它的方向，结果可能会改变我们对生物学和疾病的基本理解。”

脆性X综合征是一种由脆性X (FMR1)基因DNA序列中CGG重复扩增引起的遗传病。患有脆性X染色体的人患有智力障碍以及行为和学习方面的挑战。认知障碍从轻微到严重不等，男孩比女孩更容易受到影响。虽然特殊教育、语言治疗、物理治疗或行为治疗以及缓解症状的药物等干预措施可以为优化各种技能提供机会，但目前还没有治愈脆性X染色体综合征的方法。

在显微镜下观察时，含有重复扩增的FMR1基因被检测为夹住X染色体单臂尖端的窄带(鉴定为脆弱位点)。FMR1基因的蛋白质产物(FMRP)的主要功能是结合多达1000种不同的mrna并抑制它们的翻译。当FMRP缺失时，如脆性X综合征，大脑中会过量产生数百种不同的蛋白质。FMRP对mRNA翻译的控制在突触可塑性和高级脑功能中起着至关重要的作用，尽管其机制尚不完全清楚。没有FMRP，正常的神经发育就不会发生。

正常情况下，人类在FMR1基因中有5到55个CGG重复序列。当个体在FMR1基因序列中有超过200个CGG重复时，就会发生脆性X综合征。该疾病的传统模型认为，一旦CGG重复长度达到200或更多，该基因就会甲基化并关闭，并且不会产生FMR1 RNA或FMRP。

Berry-Kravis博士是儿科、神经科学、解剖学和细胞生物学教授，他利用了患有脆性X染色体的男性的血液样本。发现了一些意想不到的事情。

“我们有理由相信，脆性X患者产生的一些mrna存在缺陷，我们进行了实验，并开始观察各种RNA读数，然而，我们惊讶地发现，即使没有蛋白质产生，细胞也会产生脆弱的X mRNA。它们不应该产生任何脆弱的X信使rna。这是不应该发生的。这让我们重新思考这种疾病是如何在基本的生物学水平上发生的。”

Shah仔细观察携带突变的脆性X mRNA，发现了一种鲜为人知的异常剪接异构体：一种称为FMR1-217的序列变异。在mRNA被核糖体翻译成具有功能的蛋白质之前，它要经历一个被称为剪接的过程。这个中间过程去除RNA的所有非编码区域(内含子)，并将蛋白质编码区域(外显子)拼接在一起。人们相信这种剪接机制的变化，被称为选择性剪接，允许单个基因产生不同的RNA同种异构体。这些同工异构体，因为它们各自包含不同的编码区，允许一个基因制造多种蛋白质。

然而，在FMR1基因突变中发现的CGG重复序列引起了错误剪接事件，在成熟的mRNA中留下了一个关键的内含子片段(伪外显子)。这个简单的剪接错误是FMRP没有产生的原因，而不是像之前认为的那样是基因的甲基化。Richter和Shah假设，如果这种错误剪接可以被纠正或避免，那么可以恢复正常的脆性X蛋白的产生。

改变RNA剪接的一种方法是创造一个反义寡核苷酸(ASO)，这是一段具有互补序列的DNA短片段，它将与目标mRNA结合。这种结合导致剪接机制跳过RNA上不合适的剪接位点，导致正常剪接和成熟的mRNA形成。这项技术已经在临床应用于治疗神经肌肉紊乱性脊髓性肌萎缩症(SMA)，并在其他神经系统疾病的临床试验中得到应用。

为了设计针对脆弱的X mRNA的ASO，研究人员求助于ASO专家沃茨博士，他也研究亨廷顿氏病和肌萎缩侧索硬化症等神经系统疾病。RNA治疗学教授Watts设计了11种ASOs，试图找到一种能够阻止脆弱的X RNA的错误剪接并恢复FMRP生产的ASOs。Watts开发的两个ASOs组合成功地抑制了异常剪接，并在患者来源的细胞中恢复了正常的FMR1 mRNA剪接。这导致这些细胞产生正常水平的FMRP。

Richter说:“使用脆性X染色体的小鼠模型，我们永远不会发现这一点。小鼠模型是基因敲除。因为它没有脆弱的X基因，所以没有mRNA生成。FMR1 mRNA错剪接是一种依赖于CGG扩增的基因调控机制，可能是人类和灵长类动物所特有的。我们之所以发现这种错误拼接，是因为我们在人类细胞中进行了研究。”

Richter及其同事希望将这一发现转化为临床可以加快，因为目前对SMA的治疗是基于类似的技术。两者之间的唯一区别是用于治疗脆性X剪接错误的ASO的基因序列。

“这是一个非常令人兴奋的发现，具有很高的治疗潜力，”Berry-Kravis说。“然而，这还处于研究的早期阶段，还需要做很多工作来确定ASO策略在多大程度上能有效地恢复FMRP，以及在多大比例的大脑细胞和哪些患有脆性X染色体的个体中恢复FMRP，如果ASO策略在很大比例的脆性X染色体个体的细胞中成功，这可能提供一种疾病的基因逆转，可能具有很高的临床影响，提高脆性X染色体患者的功能水平，并减轻照顾者的负担。”

这项研究的部分资金由美国国立卫生研究院、西蒙斯自闭症研究基金会、FRAXA研究基金会和马萨诸塞大学陈桥基金会提供。脆性X团队的下一步将是与一家商业企业建立合作伙伴关系，这将有助于将ASO工作最终用于治疗脆性X综合征的人体临床试验。

FRAXA研究基金会的首席科学官Michael Tranfaglia博士说:“FRAXA资助Richter和Berry-Kravis实验室进行一项关于脆性X染色体异常剪接事件的创新研究，着眼于作为生物标志物的潜在用途。”“在这项研究过程中，这些杰出的科学家偶然发现了一些真正具有变革性的东西，改变了我们对脆性X本身的基本理解。除此之外，这一发现的治疗潜力确实是非凡的。”

Richter博士及其同事还于2022年获得了麻省大学陈分校BRIDGE基金的资助，用于设计和测试用于恢复脆弱X蛋白生产的ASO。

“在BRIDGE基金的帮助下，Richter博士的实验室证明了反义寡核苷酸有效地阻断了不适当的FMR1剪接，并将FMRP恢复到正常水平，”麻省大学BRIDGE创新和商业发展执行主任Huseyin Mehmet博士说。

脆性X团队的下一步将是与一家商业企业建立合作伙伴关系，这将有助于将ASO工作最终用于治疗脆性X综合征的人体临床试验。

文章标题

Antisense oligonucleotide rescue of CGG expansion–dependent FMR1 mis-splicing in fragile X syndrome restores FMRP