抗Nephrin自身抗体 指示相关肾病综合征疾病活动性的新指标？

　　研究表明，抗Nephrin自身抗体可以诱导足细胞病变表型；抗Nephrin自身抗体可作为相关的肾病综合征的疾病活动性指标，辅助指导治疗方案。

　　

背景

导致肾病综合征的肾脏疾病的特征是尿液中蛋白质含量过高，这种现象通常是由肾脏损伤——特别是足细胞损伤引起的。足细胞是肾小球滤过屏障的特化上皮细胞。严重足细胞病包括微小病变肾病、原发性局灶节段性肾小球硬化（FSGS）、以及儿童特发性肾病综合征等，往往具有重叠的组织学特征——如足细胞足突的广泛消失。在微小病变肾病和复发性FSGS患者中观察到的抗Nephrin抗体可能有助于深入理解其背后的机理。Nephrin是复杂足细胞裂膜结构的关键蛋白，具有广泛的信号功能；基因突变或实验性敲除Nephrin会导致严重的足细胞损伤发生。 

研究亮点

来自德国汉堡大学及国际肾小球疾病学会（ISGD）会长的Tobias B. Huber 教授团队进行了一项多中心研究，开发了检测抗Nephrin自身抗体的新方法，并在经活检证实肾小球疾病的成人患者、特发性肾病综合征的患儿和对照组中检测对比了这些自身抗体的存在情况。在临床随访中进一步评估了这些抗体与疾病活动性之间的关系，并在实验环境中探索了抗Nephrin自身抗体对足细胞的病理生理作用模式。 

首先要开发有效的定性和定量检测方法

传统抗Nephrin自身抗体的检测具有挑战性。直接免疫印迹（Western blotting）不能有效检测抗Nephrin自身抗体，可能是因为自身抗体的丰度或亲和力较低；因此需要一种高度灵敏的检测方法。作者使用免疫共沉淀法富集靶标以优化抗nephrin自身抗体的检测的特异性，实现可靠的定性鉴定。具体而言，使用重组人Nephrin外结构域（氨基酸A36至L1052）蛋白，将蛋白与人血清或血浆孵育过夜，然后加入蛋白G，收集免疫沉淀物，电泳，印迹，用抗Nephrin抗体(AF4269；R&D Systems)进行检测。样本以盲法分析，在确定抗Nephrin自身抗体状态后，疾病诊断和临床数据才予以揭示。研究证明，这种抗体定量可以通过提供非侵入性替代诊断，增强治疗评估，证实复发性原发性FSGS患者的肾移植策略，有望改变肾病综合征的管理。 

新的定量检测方法

作者还另外开发了一种淀粉-淀粉免疫沉淀-ELISA杂交来定量抗Nephrin自身抗抗体水平。在纳入研究时，该方法可靠地检测到59例成人疾病或原发性FSGS患者中检测到循环抗Nephrin自身抗体，而17例膜性肾病患者和18例健康对照仍为阴。测量的抗Nephrin自身抗体水平与尿核白蛋白-肌酐ratio（r=0.64）之间有很强的相关性。                            

抗Nephrin自身抗体与疾病相关性

有了可靠的定性和定量检测方法，研究小组对539名患者（357名成人和182名儿童）和117名对照组样本进行检测分析。在成人患者中，105例微小病变肾病患者中有46例（44%）发现了抗Nephrin自身抗体，74例原发性局灶节段性肾小球硬化患者中有7例（9%）发现了抗肾上腺素自身抗体，在其他症状患者中仅罕见发现个例。182例特发性肾病综合征患儿中，94例（52%）检测到抗Nephrin自身抗体。在未接受免疫抑制治疗的活动性微小病变疾病或特发性肾病综合征患者亚组中，发现抗Nephrin自身抗体的比例分别高达69%和90%（见图）。抗Nephrin自身抗体阳性的患者的症状比阴性患者要更为严重，尽管两组肾功能相差不大。 

作者还检测了38例微小病变肾病或原发性FSGS成年患者的163例随访血清样本，通过免疫沉淀在血液样本中抗Nephrin自身抗体，这些血液样本是在非预定随访时间下获得的。分析表明，抗Nephrin自身抗体的存在与否，与活动性疾病和复发相关，线性重复测量模型显示抗Nephrin自身抗体活性和尿液中的蛋白水平之间有很强的相关性，这表明抗nephrin自身抗体水平与疾病活动性相关。 

抗Nephrin自身抗体检测的应用案例

以一名Nephrin自身抗体相关的微小病变肾病的病程作为Nephrin自身抗体检测的临床应用案例：该患者在51个月的观察期间，有3次复发性肾病综合征发作——前两次用葡萄糖皮质激素和环孢素A的免疫抑制治疗获得暂时缓解，其病程中用免疫沉淀测定抗Nephrin自身抗体阳性，联合免疫沉淀定量测定抗Nephrin自身抗体水平与尿白蛋白与肌酐比值密切相关；第三次复发用利妥昔单抗治疗后，无法检测到抗Nephrin自身抗体、无蛋白尿，达到临床缓解。结果提示抗Nephrin自身抗体可作为抗Nephrin相关足细胞病变患者疾病活动的指标。 

两例抗Nephrin自身抗体阳性的患者(一例复发微小病变肾病，一例复发的原发性FSGS)在前瞻性使用利妥昔单抗治疗后均进入免疫学和临床缓解。

因此，抗Nephrin自身抗体可作为抗Nephrin相关足细胞病变患者疾病活动的指标。 

抗Nephrin自身抗体致病的动物模型验证

接下来，他们还在实验模型中验证了抗Nephrin自身抗体可以诱导足细胞病变表型。用小鼠Nephrin外结构域主动免疫小鼠可诱导抗Nephrin自身抗体生成，随后在免疫后3周迅速发展为肾病综合征，伴有高白蛋白与肌酐比率，血清白蛋白水平降低，胆固醇水平升高。电镜显示Nephrin免疫的小鼠足细胞足突弥漫性消失，而对照组小鼠则没有，结果与组织学上的微小病变肾病一致。免疫金标记的小鼠IgG在Nephrin免疫小鼠中显示其定位于消失的足细胞足突之间的区域。在Nephrin免疫小鼠中，功能性裂隙隔膜的丧失与先前描述的Nephrin酪氨酸磷酸化的后果是一致的。数据表明，抗Nephrin自身抗体在蛋白质组学水平上诱导肾病综合征、肾素磷酸化和细胞重排，导致典型的微小改变疾病的超结构改变。

结论

本研究表明，血液中的抗Nephrin自身抗体在微小病变肾病或特发性肾病综合征患者中很常见，可视为是疾病活动的标志。它们可诱导足细胞功能障碍和肾病综合征，这突出了它们的病理生理学意义。因此，抗Nephrin自身抗体可作为抗Nephrin相关足细胞病的疾病活动性指标。