人工染色体重大进展：单拷贝人类人工染色体HAC

　　人类人工染色体HAC从头合成一直受限于着丝粒复杂结构的构建难题，新一期Science报告了人类人工染色体工程新突破：一种有效地生成单拷贝HACs的方法，约750kb的构建体足够容纳着丝粒上的多域染色质，避免了多聚化问题。新方法将为哺乳动物细胞背景下进行忠实的染色体工程研究铺平道路。

　　

长期以来，细菌和酵母人工染色体（BAC，YAC）一直是合成生物学家用来改写基因组的载体。哺乳动物系统人工染色体工具非常有限。在第一个人类人工染色体(HACs)被开发出来的四分之一个世纪之后，宾夕法尼亚大学的Gambogi等人开发了一种新的、能解决过往多聚化不受控问题的构建方案。他们构建的HAC约为750千碱基，足以容纳细胞分裂所需的着丝粒上的多域染色质（multidomain chromatin）。随着细胞递送方法的简化，这些发展为推进哺乳动物和许多其他真核生物的染色体工程提供了手段。

 

着丝粒是染色体的一个特殊区域，负责在细胞分裂过程中将染色体正确分配到两个子细胞中。在哺乳动物细胞中，着丝粒比酵母着丝粒大1000多倍，不仅包含特定的DNA序列，还包含大量的表观遗传标记和蛋白质复合体，这些因素共同确保了染色体的稳定遗传。在以往的HACs研究中，由于构建体不够大，往往需要多个构建体多聚化来形成足够大的着丝粒区域，但这种多聚化过程难以控制，导致了HACs的不稳定性和其他问题。而在这项研究中，通过使用一个足够大的构建体，研究者们可以直接在构建体中包含所需的多域染色质，从而避免了多聚化的需要，这有助于形成更稳定、功能性更强的HACs。这种方法简化了HACs的创建过程，并提高了其在细胞中的稳定性和功能性。

 

摘要： 大型DNA组装技术的发展在合成细菌BAC和酵母染色体YAC领域取得了里程碑式的成就。然而，人类人工染色体（HACs）的创建受到哺乳动物着丝粒复杂性和DNA多聚化问题的限制。Gambogi等人现在开发了一种高效形成单拷贝HACs的方法，使用约750千碱基的大型构建体，足以容纳着丝粒处的多域染色质，从而避免了多聚化的需求。这一突破性进展，结合使用酵母原生质体融合的简化递送方法，为哺乳动物和其他真核生物的染色体工程铺平了道路。

 

引言： 人工染色体，如酵母人工染色体（YACs），在分子生物学中发挥了重要作用，使得大型基因的克隆和合成原核生物基因组的创建成为可能。然而，HACs的发展受到哺乳动物着丝粒复杂性和DNA多聚化问题的制约。从头合成HAC 步骤中伴随初始DNA构建体数量可变的多聚化（往往难以控制）和不受控制的重排（通常同样无意地掺入部分天然染色体）严重阻碍了它们向合成生物学和治疗应用的更广泛前景的发展。本文介绍了一种解决这些挑战的新型HAC形成方法。

 

 

结果：

• 高效HAC形成的全新平台： 研究人员设想更大的初始构建体可避免多聚化，初始构建体需要比早期版本的基于 BAC 的 HAC 构建体更大，来适应定义功能着丝粒的两个不同染色质域的形成。从更大的初始构建体开始将绕过这一要求，从而使得合成 HAC 无需多聚化步骤。

  作者采用三项最新的技术进步来构建和测试单拷贝 HAC 构建。首先，通过转化相关重组 (TAR) 克隆很容易生成 0.5 至 2 Mb 大小范围的 YAC 构建体。其次，绕过 HAC 形成所需的长（>40 kb）高度重复着丝粒 DNA（α-卫星）片段的要求，允许使用非重复 DNA。这一点至关重要，因为 TAR 克隆与长重复序列不兼容 。第三，通过与酵母原生质球的优化融合，大型 YAC 构建体可以有效地递送至哺乳动物细胞。相对于先前版本中基于 BAC 的 HAC 载体的低效转染传递所实现的结果，可能会导致独立 HAC 形成事件显着增加。

  新构建体命名为 YAC- Mm -4q21 LacO，包含 550 kb蕈状支原体基因组 DNA、4q21 BAC LacO 的 YAC，以及用于重组的接头，其中还包括酵母营养缺陷标记和 mCherry 的哺乳动物表达盒。
  
  
• YAC-Mm-4q21LacO HACs拥有多域着丝粒：合成的HACs经过验证具有支持有丝分裂功能的能力。发现HACs作为自主染色体遗传，具有功能性的动粒和强大的CPC招募，这表明更大的构建体尺寸允许形成一个无需多聚化的功能性着丝粒。这赋予 YAC- Mm -4q21 LacO HAC 与天然对应物一样在有丝分裂中以高保真度分离的能力。
  
  

讨论：

• 作为平台的全新HACs： 该研究的HACs代表了一种可行的平台，用于创建具有完全设计DNA序列的新哺乳动物染色体，为生物学和应用用途提供了巨大潜力。
• HAC设计和递送的进步： 使用酵母原生质体融合的HAC递送方法比转染更高效，允许快速评估HAC功能，加快了HAC调试的步伐。
• 潜在应用： 人工染色体可用于在各种真核生物中传递有用的遗传信息，YAC-Mm-4q21LacO基础的人工染色体可以被修改并扩展到多种有用的生物系统中。

结论： 本研究在HAC设计、递送、形成和功能方面取得的进步预计将加快基于发现的和应用的基因组科学。能够创建无需多聚化的具有功能性着丝粒的单拷贝HACs，在染色体工程领域是一个重大进展，并对研究、生物技术和与健康相关的应用产生广泛影响。