从HiFi测序角度解惑细胞与基因治疗的神话

　　腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)是在基因治疗载体上实验最活跃的病毒之一使用AAV的基因疗法和CAR-T等细胞疗法有可能治愈以前无法治愈的疾病。尤其是CAR-T细胞癌症治疗，在对抗这种毁灭性疾病方面显示出巨大的希望。2023年，FDA批准了几种新的基于AAV的疗法和基于细胞的基因疗法，用于治疗杜氏肌营养不良症、严重血友病A和镰状细胞病。

　　

细胞和基因治疗研究对生物制药开发至关重要，HiFi长读测序在整个过程中显著增强了许多测序应用。尽管AAV测序是基因组学的最新应用之一，但它也是当今疾病研究中最有前途的应用之一。腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)是在基因治疗载体上实验最活跃的病毒之一使用AAV的基因疗法和CAR-T等细胞疗法有可能治愈以前无法治愈的疾病。尤其是CAR-T细胞癌症治疗，在对抗这种毁灭性疾病方面显示出巨大的希望。2023年，FDA批准了几种新的基于AAV的疗法和基于细胞的基因疗法，用于治疗杜氏肌营养不良症、严重血友病A和镰状细胞病。

AAV载体的设计对基因治疗研究产生了影响，这可能是对抗这些疾病的最后一站，也许还有更多。高度精确的长读测序支持研究设计、验证和优化使用这种病毒载体的潜在基因疗法。

如今PacBio公司来解惑HiFi测序在细胞和基因治疗研究中的常见误解。

1:PacBio HiFi测序在开发和评估或优化基因治疗产品设计、疗效和潜在安全性时过于昂贵。

事实:这种说法具有误导性。

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载体设计在基因治疗开发的成功中起着至关重要的作用。在细胞和基因治疗中，安全性是最重要的，研发过程也非常漫长，意想不到的错误可能会迅速破坏多年的工作，可能会推迟那些需要挽救生命的治疗。全面准确地描述AAV产品的特征可以降低临床试验中代价高昂的失败风险。

全面了解靶标编辑和脱靶编辑、载体或构建体整合以及插入突变是验证AAV产品设计和确保其可制造性的关键组成部分。使用特殊的精度和长度的HiFi读数意味着你可以对你的产品设计充满信心，避免意外的支线。

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2:PacBio长读取只适用于从头开始的基因组组装。

事实:这个陈述是不完整的。

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高保真阅读器对组装基因组很有好处，这是真的，但它们能做的远不止这些。

细胞计数和基因治疗研究是HiFi测序的众多应用之一。无论是全长AAV测序，基因编辑评估，质粒或扩增子库筛选，还是载体整合，>20 kb reads和99.9%准确率的HiFi的成功组合都可以让您检测短读测序可能错过的变体或事件。

你可以在AAV基因治疗发展的每个研究阶段使用HiFi测序:发现AAV载体:通过靶向测序发现新的衣壳。优化AAV载体设计:通过观察截断、碎片和其他非全长异常的频率来改进设计。

确认mRNA转录本:通过全长同种异构体测序量化同种异构体。

研究宿主整合:了解这些事件的频率，以确保产品的潜在安全性和有效性?确保AAV生产的质量比较载体和未解析的基因组，并评估由不同平台制作的载体准备

那么基因编辑呢?HiFi测序可以通过以下方式为你的基因编辑研究提供动力:评估基因插入CRISPR目标位点导致的indel和其他突变?检测罕见的脱靶突变。了解在等位基因特异性Cas9切割的情况下单倍型和SNVs对基因编辑的影响?通过使用无扩增方法避免PCR偏差和局限性

3:准确性对于表征AAV杂质并不那么重要，比如部分基因组。

事实:这种说法是错误的。

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在所有科学领域，准确性都是至关重要的，在细胞和基因治疗研究中，这种风险可以说更高，因为临床试验、患者结果和改变生活的治疗方法都处于危险之中。

借助高精度的HiFi长读数，您可以评估AAV中的杂质，如部分基因组，同时获得有关序列一致性的关键信息。PacBio HiFi测序将长读数的优势与桑格水平的准确性结合起来。这意味着您可以使用一种技术来监控和改进AAV的发现和制造，降低成本高昂的故障风险，从而将开发时间表推迟数月甚至数年。

缺少关于矢量质量的关键信息可能会影响设计的有效性。

4:配对纳米孔与是最简单的方法来表征AAV从倒置串联重复序列(ITR)到ITR。

事实:这种说法是短视的。

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ONT和short-reads都不能完全解析ITRs，使用short-reads时需要额外的生物信息学比对工作。当你能做得更好的时候，为什么要进行多次分析?高度精确的长读测序结合了准确度和阅读长度，你需要在一个实验。永远不要再因为精确度太低或太短而无法对齐而丢弃读取。此外，具有HiFi读数的长读段测序支持广泛的应用，这些应用对细胞和基因治疗产品的设计和开发至关重要，包括:AAV测序、基于扩增子的构建筛选、基因编辑和靶向和脱靶评估、全长质粒测序、载体整合、RNA测序和全基因组测序。

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5:AAV复杂到难以使用PacBio HiFi测序。

事实:这种说法不正确。

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PacBio和Form Bio的合作伙伴为AAV测序和数据分析提供端到端的工作流程，在一个一体化的解决方案中优化您的AAV载体设计。该工作流程适用于使用相同协议的ssAAV和scAAV测序。Form Bio工作流程经过PacBio认证兼容，并提供分析软件来帮助您分析和可视化AAV数据，从而节省时间和资源。

参考文献

• Naso MF, Tomkowicz B, Perry WL 3rd, Strohl WR. Adeno-Associated Virus (AAV) as a Vector for Gene Therapy. BioDrugs. 2017 Aug;31(4):317-334. doi: 10.1007/s40259-017-0234-5.

• ELEVIDYS. Published July 13, 2023. Accessed October 20, 2023.

• ROCTAVIAN. Published July 26, 2023. Accessed October 20, 2023.

• FDA Approves First Gene Therapies to Treat Patients with Sickle Cell Disease.  Published Dec 8, 2023. Accessed Dec 20, 2023.