他山之石可以攻玉：PacBio HiFi测序应用6月精选

　　PacBio HiFi测序技术仍然是基因组学专业人员在发现前沿工作的首选工具，使他们能够在生物学的不同领域寻求新的探索途径。

　　

2024年6月的PacBio博客系列重点介绍了以下几篇科学论文。这些引人注目的研究成果突显了PacBio测序在单细胞RNA-seq分析方面的独特能力：揭示片段重复，以更好地了解人类疾病，进化和多样性，实现物种水平的分辨率，等等。

Kinnex单细胞RNA测序

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基于长读测序平台的单细胞RNA-seq分析性能的系统评价

来自中国广州医科大学的研究人员评估了第三代测序（TGS）的代表PacBio和ONT在单细胞分析的不同方面的表现，文章发表在《Journal of Advanced Research》。研究采用10x genomics scRNA-seq，从含有不同数量细胞的相同单细胞cDNA文库中生成了ONT和PacBio数据，并与基准NGS进行了比较。与NGS相比，三代测序平台产生了更一致的基因表达谱。其中，ONT获得的cDNA reads更多，而PacBio在CB鉴定中表现更好。两种三代测序技术在小细胞样本量的细胞注释方面都优于NGS技术。两者对不同的基因异构体检出有分歧。当文库中的输入细胞较少时，在每个细胞中捕获的基因较多；在较大的细胞样本量中可以以较低的基因检测灵敏度鉴定出更多的细胞类型特异性分子。PacBio鉴定出更多的细胞类型特异性基因和同工型，更便于分析单倍型表达。使用PacBio数据鉴定的新异构体更为准确。系统的评估为研究人员选择适合单细胞研究策略提供指导。

• 基于三代测序的scRNA-seq数据可独立用于生成单细胞基因/异构体表达矩阵。

• 尽管由于测序通量有限，基因检测灵敏度相对较低，但基于三代测序的scRNA-seq能够准确捕获所有细胞类型。

• PacBio在发现新的转录本方面表现出色。

• 两种三代测序技术都能够确定转录读段的等位基因起源，PacBio可以识别更多的等位基因特异性转录本。

结论
二代测序 scRNA-seq只能提供的基因表达分析，三代测序 scRNA-seq在此基础上还实现了基因剪接分析，鉴定了新的同工型。由于PacBio的测序质量更高，它在新转录物鉴定和等位基因特异性基因/异构体表达的准确性方面优于ONT。

人口测序

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人类片段复制的结构多态性和多样性

在这个预印本中，高保真显示了短读无法解析的片段重复(sd)。这些缺失的信息对于理解人类疾病、进化和多样性至关重要。来自HGSVC、UW、Altos Labs、JAX和CMKC的研究人员进行了一项研究，包括“通过分析170个(所有HiFi)人类基因组组装，对SDs进行了群体遗传学调查，其中大多数SDs都是使用长读序列组装完全解析的。”

主要结论:

• “尽管它们很重要，但了解基因组中这些更复杂区域的遗传多样性一直具有挑战性。”

• “PacBio HiFi(高保真)测序技术和相关组装算法的发展意味着大多数SD区域可以在单倍型水平上完全测序。”

• 我们鉴定了173.2 Mbp的重复序列(47.4 Mbp不存在于端粒到端粒的参考中)，以区分固定和结构多态性事件。

• “与非非洲样本相比，非洲基因组具有更多的染色体内SDs，并且更有可能具有拷贝数较高的近期重复基因家族。”

• “与5.63亿全长Iso-Seq reads的资源进行比较，确定了201个新的、潜在的蛋白质编码基因，与这些拷贝数多态性SDs相对应。”

 

结论:

了解基因组中更复杂区域(即SDs)的遗传多样性及其表达的转录物同工型对于了解人类疾病、进化和多样性至关重要。使用HiFi WGS和Kinnex独特地解析基因组和转录组中任何其他技术无法访问的区域。

 

基因调控

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人类基因调控的单倍型解析观点

在这份预印本中，一组来自华盛顿大学、弗吉尼亚梅森方济会健康中心的Benaroya Res研究所、华盛顿州Talus生物科学中心、西雅图儿童医院、梅奥医院和Brotman Baty的科学家发现，“纤维序列推断调控元件(FIREs)能够准确定量6 Gbp二倍体人类基因组的染色质可及性，具有单分子和单核苷酸精度。”

关键外卖:

• “我们发现细胞可以容纳超过1000个具有单倍型选择性染色质可及性(HSCA)的调控元件，并表明这些元件优先定位于包含最多人类遗传多样性的基因组位点，人类白细胞抗原(HLA)位点在免疫细胞全基因组中显示出最多的HSCA。”

• “我们发现了具有序列非确定性染色质可及性的HSCA元件，代表了可能的体细胞增殖。”

• 使用“配对单倍型阶段长读转录数据[Kinnex]”，“这种方法还以核苷酸精度解开了人类非活性和活性X染色体上的基因调控。”

结论:

“FIRE可以实现精确新创直接使用长读测序数据构建细胞染色质可访问的景观，使同步多组长读测序成为可能。”

 

宏基因组

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丹麦微生物群:丹麦环境微生物群图谱

在这篇预印本中，来自丹麦、澳大利亚和奥地利的科学家进行了一项研究，利用HiFi测序技术对449个微生物组样本(1490万个细菌样本(中位数4528 bp，同时包含16S和23S)和1340万个真核生物rRNA操纵子序列(中位数4035 bp，同时包含18S和28S)进行了rRNA操纵子测序。“这个数据集比目前最全面的数据库SILVA 138.1大一个数量级”，并提供了“前所未有的资源和回答微生物生态学基本问题的基础:是什么驱动了微生物的多样性、分布和功能。”

结论:

准确的全长测序(16S- its - 23s, 18S-ITS-28S扩增子)提供高质量，物种水平的分辨率，提高对微生物多样性，分布和功能的理解，准确的高通量长扩增子测序与Kinnex 16S测序能够全面的微生物群落特征