G-四链体结构模体调控转录组内蛋白质-RNA相互作用的新机制

　　本研究针对RNA结合蛋白FUS在神经退行性疾病和癌症中的关键作用，开发了G4 RIP-seq技术，通过在G4稳定(K+)和非稳定(Li+)条件下分析，发现G-四链体(rG4)结构显著调控FUS与靶RNA的结合。研究揭示了rG4在核糖体合成、离子通道调控等通路中的新型调控机制，为FUS相关疾病提供了新的治疗靶点。

　　

在分子生物学的复杂世界中，RNA结合蛋白（RBP）如同精准的指挥家，调控着RNA的生命周期——从转录、剪接到降解。其中，FUS蛋白（Fused in Sarcoma）因其在肌萎缩侧索硬化（ALS）和癌症中的关键作用而备受关注。然而，尽管已知FUS通过GU富集序列与RNA相互作用，其精确的识别机制仍笼罩在迷雾中。更引人深思的是，RNA的二级结构，尤其是非经典结构G-四链体（G4），是否在FUS的结合中扮演角色，成为了一个亟待解答的科学问题。

传统的共识认为，蛋白质与RNA的相互作用主要基于序列特异性。但近年来的研究逐渐揭示，RNA的空间构象同样重要。G4结构由鸟嘌呤通过Hoogsteen氢键自组装形成，在基因表达和基因组稳定性中发挥重要作用。FUS的RGG结构域已被证明与个别G4结构（如端粒RNA TERRA）结合，但这种相互作用是否具有普遍性，以及其功能意义如何，仍缺乏全局性的认识。尤其是在神经退行性疾病中，FUS的突变会导致异常的液-液相分离（LLPS）和聚集，理解其结合机制对于揭示疾病机理至关重要。

为此，Bhatt等人在《Genome Biology》上发表了他们的最新研究。他们开发了一种创新的G4 RIP-seq技术，通过在钾离子（K⁺，稳定G4）和锂离子（Li⁺，非稳定G4）条件下进行RNA免疫沉淀测序，全面解析了G4结构对FUS-RNA相互作用的影响。研究发现，G4结构广泛参与FUS的靶标识别，不仅增强了与核糖体RNA等的结合，还抑制了与离子通道RNA的结合，从而揭示了RNA结构在转录组调控中的核心地位。

研究团队运用了多项关键技术：首先，他们利用SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞系提取总RNA；其次，通过His₆标签的重组FUS蛋白（仅包含C端RNA结合域，aa 269-526）进行RNA结合和UV交联；第三，在K⁺和Li⁺缓冲液中退火RNA以控制G4形成；第四，使用免疫沉淀和高通量测序（G4 RIP-seq）分析结合差异；最后，通过圆二色谱（CD）、热差光谱（TDS）和电泳迁移率变动分析（EMSA）验证关键G4结构与FUS的相互作用。

研究结果首先通过Western blot和RT-qPCR证实了实验的可靠性。与IgG对照相比，FUS在已知靶标如NEAT1_2、MALAT1和TERRA上显示显著富集。测序数据揭示了23,520个基因与FUS结合，其中与SH-SY5Y细胞的CLIP-seq数据重叠率达95%，表明G4 RIP-seq高度重现了细胞内相互作用。

全局分析显示，17.6%的基因在K⁺条件下富集（G4增强结合），19.5%的基因在Li⁺条件下富集（G4抑制结合）。3,337个基因显示结合差异超过1.5倍，其中56个达到统计显著性（FDR < 0.05），且93%为K⁺富集。这些基因富含非编码RNA（如lncRNA和假基因），提示G4在非编码调控中的重要作用。

基因集富集分析（GSEA）表明，K⁺条件下FUS结合增强的基因主要涉及核糖体合成和翻译通路（如RPL23A），而结合减少的基因与配体门控离子通道（如乙酰胆碱受体）相关。这提示G4可能通过调节FUS与不同功能RNA的结合，影响细胞增殖和神经信号传递。

为了探究G4是否直接作为FUS的结合位点，团队分析了G4预测（pG4）与CLIP-seq结合位点的重叠。发现两者显著共定位（p ≤ 0.0001），且随机分布无法重现该模式，证实G4是FUS的结构性靶标。

研究进一步验证了三个关键基因（RPL23A、S100A6和COPS9）中的pG4序列。通过TDS和CD光谱，证实这些序列在K⁺条件下形成平行拓扑G4结构，而在Li⁺条件下结构不稳定。突变实验（鸟嘌呤替换为尿嘧啶）则完全破坏G4形成。

EMSA分析显示，FUS与野生型G4 RNA在K⁺条件下的结合显著强于Li⁺条件，而突变体则结合丧失。超移实验（anti-His抗体）进一步确认了复合物特异性。这些结果直接证明G4结构是FUS结合的必要条件，而非仅依赖G富集序列。

综上所述，本研究首次在转录组尺度上揭示了G4结构作为FUS-RNA相互作用的关键调控因子。不仅证实了G4在结合中的直接作用，还发现了其对功能通路的特异性调节：增强与翻译相关RNA的结合，同时抑制与神经信号RNA的结合。这为理解FUS在疾病中的功能提供了新视角——例如，在ALS中，G4结构的异常可能通过扰乱FUS的RNA结合，导致毒性聚集和信号通路失调。

研究的创新之处在于将生化条件（离子环境）与高通量测序相结合，克服了体内G4动态性的限制，提供了全局性见解。此外，G4 RIP-seq技术与细胞CLIP-seq的高度一致性，也证明了其可靠性。未来，针对G4结构的小分子调控剂可能成为治疗FUS蛋白病（如ALS和癌症）的新策略。总之，这项工作不仅深化了对RNA结构在蛋白识别中作用的理解，也为疾病治疗提供了潜在靶点。