猪克隆胚胎来源扩展潜能干细胞的无饲养层培养及其转录组特征解析

　　本研究针对猪克隆胚胎来源扩展潜能干细胞(pEPSCNT)存在建系效率低、转录组特征不明和无饲养层培养体系缺乏等问题，通过优化培养系统成功建立了三种不同来源的pEPSC系。研究发现pEPSCNT具有独特的转录组特征（富集8细胞至桑椹胚期基因特征）和双向分化潜能（胚胎三胚层和滋养层分化），并首次开发了基于2x Matrigel的无饲养层培养系统，为猪干细胞在再生医学和农业生物技术中的应用提供了重要技术平台。

　　

在干细胞研究领域，猪多能干细胞（pPSC）因其与人类相似的生理学和免疫学特征，被认为是再生医学和疾病建模的理想大动物模型。然而数十年来，稳定猪多能干细胞的建立始终面临巨大挑战，获得的细胞多被称为"类胚胎干细胞（ES-like cells）"，其真正的多能性状态和临床应用潜力受限。2019年以来，随着扩展潜能干细胞（EPSC）概念的提出，科学家们成功建立了猪扩展潜能干细胞（pEPSC），这些细胞具有分化为胚胎和胚外谱系的独特能力，为干细胞研究开辟了新天地。

尽管如此，猪EPSC研究仍存在三个关键瓶颈：首先是克隆胚胎来源干细胞（pEPSC_NT）建系效率低且稳定性差；其次是对pEPSC转录组特征的认识不足；最重要的是缺乏标准化的无饲养层培养系统，这严重限制了其大规模应用和机制研究。

为了解决这些问题，Cai等人在《Stem Cell Research & Therapy》上发表了最新研究成果。研究人员通过优化培养系统，成功从孤雌激活（PA）、体外受精（IVF）和体细胞核移植（SCNT）三种来源的猪囊胚中衍生出pEPSC系，并对SCNT来源的pEPSC_NT进行了重点研究。

研究采用的主要技术方法包括：利用屠宰场采集的猪卵巢进行卵母细胞体外成熟，通过SCNT、IVF和PA技术制备胚胎；使用改良的pEPSC培养基（含CHIR99021、WH-4-023、XAV939、LIF、Activin A和维生素C等组分）进行干细胞建系；通过免疫荧光、qPCR、核型分析等技术系统评估干细胞多能性；采用RNA测序进行转录组比较分析；测试多种细胞外基质（Matrigel、纤连蛋白、层粘连蛋白-521和玻连蛋白）优化无饲养层培养条件。

Derivation of pEPSCs from pre-implantation embryos of various origins

研究人员首先建立了三种不同来源的pEPSC系，建系效率相当（附着率71-85%，原代出芽率25-30%）。所有pEPSC系均呈现紧凑集落形态，核型正常（pEPSC_IVF为36+XY，pEPSC_PA为36+XX，pEPSC_NT为36+XY），并保持碱性磷酸酶活性，表明这些细胞具有基本的多能性特征。

Derivation and characterization of pEPSCNT lines reconstructed with porcine cloned eGFP donor cells

通过使用eGFP标记的供体细胞进行SCNT，研究人员成功追踪了pEPSC_NT的细胞谱系。发现第6天囊胚的原代出芽率显著高于第7天囊胚。pEPSC_NT高表达核心多能性因子（SOX2、OCT4、NANOG）和表面标志物（SSEA4），并能在体外分化为三个胚层，证明其具有多向分化潜能。

Transcriptomic features of pEPSCsNT

转录组分析显示pEPSC_NT与iPSC相关性最高，且与体内外8细胞期至桑椹胚期胚胎特征最为相似。这些细胞同时表达naive状态（KLF4、KLF17）、formative状态（LIN28A、DNMT3A）和primed状态（DUSP6、ZIC2）相关基因，但更倾向于formative状态，且富集EPSC特征基因（ZMYM2、DNMT3A、DUSP6、CHD7）。KEGG分析表明pEPSC_NT显著富集Hippo信号通路，这与其胚外分化潜能密切相关。

Extra-embryonic lineage and blastocyst-like structure developmental potential of pEPSCs

pEPSC_NT在自发分化过程中能形成类胚体（EB）和类囊胚结构（BLS）。第7天EB中滋养层谱系相关基因（TEAD3、PLET1、PGF、KRT8、CDX2）显著上调，第46天EB仍保持滋养层标志物表达。类囊胚结构包含上胚层样（SOX2+）、下胚层样（GATA6+）和滋养层样（CDX2+）细胞，模拟了天然囊胚的细胞谱系组成。

Verification of pEPSC cell line maintenance feasibility under feeder-free conditions

研究人员成功将pEPSC系适应于无饲养层培养条件（Matrigel涂层）。FF-pEPSC在无饲养层条件下保持核心多能性标志物表达、AP活性和增殖能力，但NT来源细胞增殖速度显著慢于PA来源细胞。

Optimization of feeder-free culture conditions for the pEPSCNT line

通过测试不同培养基组合（mTeSR1±XWCLAV）和细胞外基质（Matrigel、纤连蛋白、层粘连蛋白-521、玻连蛋白），发现2x Matrigel结合改良pEPSC培养基能最有效地支持pEPSC_NT的无饲养层培养，细胞在此条件下保持最佳增殖率和多能性标志物表达。

FF-pEPSCsNT have the potential to differentiate into trophoblasts

最终验证表明，无饲养层培养的pEPSC_NT能高效分化为滋养层细胞，表达多种滋养层特异性基因（ELF4、CDX2、GATA3、HAND1、GCM1、PGF、KRT8、ELF5）和蛋白（KRT7、CDX2、核定位TEAD4/YAP1），同时丢失多能性标志物（POU5F1、SOX2）表达。

本研究成功建立了猪克隆胚胎来源扩展潜能干细胞的无饲养层培养体系，并深入解析了其独特的转录组特征。研究发现pEPSC_NT处于一种相对接近naive状态的formative多能性状态，富集8细胞至桑椹胚期胚胎特征和Hippo信号通路，具有向胚胎和胚外谱系分化的双重潜能。研究人员开发的2x Matrigel无饲养层培养系统能有效维持pEPSC的多能性和分化潜能，解决了饲养层细胞批间差异和干扰下游分析的问题。

这项研究的重要意义在于：首先为猪干细胞研究提供了稳定高效的技术平台，推进了大型动物干细胞在再生医学中的应用；其次深入揭示了猪EPSC的分子特征和多能性状态，为比较生物学研究提供了重要依据；最后建立的无饲养层培养体系为标准化和规模化生产临床级干细胞奠定了基础。这些突破性进展不仅推动了猪干细胞领域的发展，也为人类再生医学研究和农业生物技术应用提供了新的技术手段和理论依据。