FGL1介导T1期非小细胞肺癌淋巴结转移：机制解析与靶向治疗新策略

　　本研究针对T1期非小细胞肺癌（NSCLC）中约30%患者发生纵隔（N2）淋巴结转移的临床难题，通过单细胞测序技术发现新型CCNE1(+)细胞亚群及其关键分子FGL1。研究人员综合运用多组学分析及体内外实验验证，揭示FGL1通过PI3K/AKT/HIF-1α通路调控糖酵解和上皮间质转化（EMT），促进淋巴管生成和转移。研究首次开发shFGL1_AAV9/AAV6靶向疗法，为抑制NSCLC转移提供了新的治疗策略。

　　

肺癌作为全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌（NSCLC）约占全部病例的80%。早期NSCLC（尤其是肿瘤尺寸≤3厘米的T1期）患者通常被视为根治性手术的最佳候选者，但令人困惑的是，约30%的T1期患者会出现纵隔（N2）淋巴结转移甚至远处器官转移，即使术后病理确认的隐匿性淋巴结转移也高达20-30%。这种转移现象严重影响着患者的预后，然而其分子机制至今不明。传统的肿瘤淋巴结转移研究主要聚焦于三个方向：肿瘤细胞对淋巴结微环境的代谢适应、趋化因子受体与配体的相互作用，以及肿瘤直接促进淋巴管生成。但对于T1期肿瘤的转移机制，尤其是N2淋巴结转移的具体调控途径，仍缺乏深入探索。

发表在《Experimental Hematology & Oncology》的这项研究致力于解开这个临床谜题。研究人员通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术对T1N0M0和T1N2M0的NSCLC组织样本以及转移性N2淋巴结样本进行深入分析，结合转录组测序、代谢组学、质谱分析以及多种体内外实验验证，系统阐述了FGL1（fibrinogen-like protein 1）在介导淋巴结转移中的关键作用及靶向治疗潜力。

研究采用的主要技术方法包括：单细胞测序（10x Genomics平台）鉴定细胞亚群；免疫组化（IHC）和免疫荧光（IF）检测蛋白表达；染色质免疫沉淀（ChIP-qPCR）和双荧光素酶报告基因 assay 验证转录调控机制；蛋白质免疫共沉淀（Co-IP）联合质谱分析筛选互作蛋白；体外功能实验（Transwell、划痕实验、淋巴管形成实验）评估细胞迁移和淋巴管生成能力；以及多种小鼠模型（皮下移植瘤、原位肺移植、足垫淋巴转移模型）进行体内验证。临床样本来源于唐都医院手术患者，包含316例NSCLC组织芯片（158例肺腺癌、133例鳞癌、25例腺鳞癌）和30例T1期新鲜组织。

研究结果

单细胞测序发现介导淋巴结转移的新型细胞亚群

通过对7例NSCLC样本（4例T1N0M0和3例T1N2M0）进行scRNA-seq，研究人员成功识别出72,401个细胞，将其分为9个主要亚群。上皮细胞亚群进一步聚类为8个亚型，其中高表达CCNE1基因的细胞亚群（命名为CCNE1(+)细胞）在T1N2M0样本中比例显著升高。这些细胞特异性表达CENPF、STMN1、TOP2A等增殖相关基因，拷贝数变异（CNV）分析显示其具有高度恶性特征。更重要的是，在3例转移性N2淋巴结样本中，同样发现了基因表达特征高度相似（相关性>0.9）的CCNE1(+)细胞，证实了该亚群在介导淋巴结转移中的核心作用。

FGL1在CCNE1(+)细胞中高表达且与转移功能密切关联

免疫检查点分子筛查发现，FGL1在CCNE1(+)细胞中特异性高表达。单细胞轨迹分析显示FGL1的表达与CCNE1(+)细胞的出现高度同步。基因集富集分析（GSEA）表明，FGL1(+)细胞差异表达基因显著富集于细胞粘附和转移相关通路。值得注意的是，FGL1表达主要集中于上皮细胞（尤其是CCNE1(+)细胞），而在免疫细胞（T细胞、B细胞、髓系细胞）中表达水平较低，提示FGL1可能具有独立于免疫调节功能的促转移作用。组织芯片免疫荧光染色证实，T1N2M0样本中CCNE1和FGL1共定位信号显著高于T1N0M0样本。

FGL1在NSCLC中高表达且受ETS1转录调控

对316例NSCLC组织芯片的IHC分析显示，FGL1在癌组织中的表达显著高于癌旁组织（P<0.0001），且T1N2M0样本中的表达水平明显高于T1N0M0样本（P<0.0001）。生物信息学预测和实验验证发现，转录因子ETS1直接结合FGL1启动子区的两个特定位点，正向调控其转录表达。染色质免疫沉淀（ChIP-qPCR）和双荧光素酶报告基因实验证实了ETS1与FGL1启动子的直接结合作用。

FGL1通过PI3K/AKT/HIF-1α通路调控糖酵解影响肿瘤转移

蛋白质质谱分析发现FGL1与多种糖酵解关键分子（ENOA、PGAM1、LDHA、LDHB）存在相互作用。转录组测序显示FGL1敲降后差异表达基因显著富集于PI3K/AKT信号通路和糖酵解相关通路。代谢组学分析进一步证实FGL1敲降导致乳酸、丙酮酸等糖酵解代谢物水平下降。体外实验表明，FGL1敲降显著抑制了四种NSCLC细胞系（A549、H226、H1299、H1703）的葡萄糖消耗、乳酸生成和丙酮酸产量（P<0.05）。Western blotting验证FGL1敲降抑制了PI3K/AKT/HIF-1α信号通路活化以及下游糖酵解关键分子（HIF-1α、PDK1、GLUT1、LDHA等）的表达。组织芯片分析显示FGL1表达与多种糖酵解标志物（GLUT3、LDHB、PGAM1等）呈显著正相关。

FGL1敲降通过影响糖酵解抑制肿瘤进展

在糖酵解抑制剂2-DG（2-脱氧-D-葡萄糖）处理下，FGL1敲降对细胞增殖和迁移的抑制效应显著减弱，表明FGL1的功能依赖于糖酵解过程。克隆形成和CCK-8实验显示FGL1敲降细胞增殖速率显著低于对照组（P<0.05），Transwell和划痕实验证明其迁移能力明显受损。Western blotting分析表明FGL1敲降显著抑制上皮间质转化（EMT）相关分子（TGF-β、Slug、Snail）表达，同时上调E-cadherin表达。组织芯片分析证实FGL1表达与多种EMT标志物呈正相关。

FGL1敲降抑制淋巴管形成和淋巴结转移

体外淋巴管形成实验显示，FGL1敲降的肿瘤细胞与淋巴内皮细胞共培养时，淋巴管生成显著抑制。小鼠皮下移植瘤模型中，FGL1敲降显著抑制了Lewis肺癌（LLC）和H226细胞的肿瘤生长（P<0.05）。原位肺移植模型证实，FGL1敲降显著抑制肺内转移并延长小鼠生存期（P=0.0014）。足垫移植模型进一步证明FGL1敲降明显抑制淋巴结转移（P<0.05）。免疫组化显示FGL1敲降肿瘤中淋巴管内皮标志物LYVE-1表达减少。

靶向FGL治疗策略的开发与验证

研究人员构建了shFGL1_AAV9和shFGL1_AAV6两种腺相关病毒载体进行靶向治疗验证。体内实验表明，瘤内注射shFGL1_AAV9显著抑制三种细胞系（LLC、A549、H226）的肿瘤生长（P<0.05）。在足垫淋巴转移模型中，shFGL1_AAV9联合2-DG治疗显著抑制淋巴结转移。非气管注射shFGL1_AAV6也显示出抑制肺内转移的趋势（P=0.0751）。这些结果证实了靶向FGL1治疗策略的有效性。

研究结论与意义

本研究系统阐明了FGL1在T1期NSCLC淋巴结转移中的关键作用机制。研究发现并鉴定了一个新型的CCNE1(+)细胞亚群，该亚群通过高表达FGL1，像"盾构机刀头"一样为淋巴结转移"开辟通道"。分子机制上，FGL1通过PI3K/AKT/HIF-1α信号通路调控肿瘤细胞糖酵解过程和EMT进程，促进淋巴管生成和转移。临床样本分析证实FGL1表达与N2淋巴结转移密切相关。

研究的创新点在于：首次发现CCNE1(+)细胞亚群在介导淋巴结转移中的作用；阐明FGL1除免疫调节功能外，还具有独立促进转移的新功能；揭示FGL1调控肿瘤代谢的新机制；开发出shFGL1_AAV9/AAV6等新型靶向治疗策略。这些发现不仅为理解T1期NSCLC淋巴结转移提供了新的理论基础，也为临床治疗提供了潜在的靶点和新策略，具有重要的转化医学价值。