肿瘤启动CD8+ NKT样细胞：复发难治性多发性骨髓瘤的新型高效细胞疗法

　　本研究针对复发难治性多发性骨髓瘤（RRMM）治疗困境，开发了一种通过肿瘤细胞启动脐带血单核细胞（CBMC）产生CD8+ NKT样细胞（TPNC）的创新疗法。研究证实TPNC具有双重细胞毒性机制（MHC限制性和非MHC限制性），在体外和小鼠模型中均展现卓越的抗肿瘤活性和持久性，为血液恶性肿瘤提供了无需基因修饰的通用型细胞治疗平台。

　　

多发性骨髓瘤（MM）是一种恶性浆细胞疾病，尽管蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂和单克隆抗体等标准治疗方法不断进步，但大多数患者最终会出现复发或耐药，发展为复发难治性多发性骨髓瘤（RRMM）。这类患者的生存期通常仅有2-3年，临床治疗面临巨大挑战。近年来，靶向B细胞成熟抗原（BCMA）的CAR-T细胞疗法虽然在部分患者中显示出显著疗效，但其广泛应用受到自体细胞来源、制备周期长、成本高昂以及严重免疫相关毒性（如细胞因子释放综合征和神经毒性）的限制。这些局限性促使研究人员寻找更安全、可及性更高且能快速应用的免疫治疗替代方案。

天然免疫细胞，特别是自然杀伤（NK）细胞，在慢性抗原刺激下可获得记忆样特征，包括增强的细胞毒性和炎症因子分泌能力。这类适应性NK细胞表现出克隆样扩增、表观遗传重编程和针对肿瘤抗原的强化回忆反应，成为下一代癌症免疫治疗的有力候选者。基于这一思路，研究团队尝试通过肿瘤启动策略，将脐带血单核细胞（CBMC）与经过照射的RRMM患者骨髓单核细胞（BMMC）在特定细胞因子条件下共培养，以期获得高细胞毒性的记忆样NK细胞。

出乎意料的是，该培养系统主要产生了CD3⁺CD56⁺ NKT样细胞，而非预期的NK细胞。这群被称为肿瘤启动CD8⁺ NKT样细胞（TPNC）的群体表现出强大的细胞毒性和高水平的细胞因子分泌能力。机制研究表明，TPNC通过LFA-1和DNAM-1介导的非MHC限制性途径，以及TCR介导的MHC限制性识别双重机制杀伤肿瘤细胞。它们在体内外实验中均能有效抑制肿瘤进展，延长生存期，且没有观察到明显毒性。

为了开展这项研究，团队采用了多种关键技术方法：从临床样本中分离CBMC和患者来源的BMMC；通过体外共培养系统生成TPNC；利用流式细胞术进行表型分析和功能检测；采用抗体阻断实验验证细胞毒性机制；通过TCR测序分析克隆选择；使用活细胞成像技术观察免疫突触动态；并建立异种移植小鼠模型评估体内抗肿瘤效果。研究使用的样本包括RRMM、急性淋巴细胞白血病（ALL）和急性髓系白血病（AML）患者的原代细胞。

生成和表型表征

研究团队将CBMC与经照射的RRMM患者BMMC在含有IL-2、IL-18和IL-21的细胞因子条件下共培养。到第21天时，CD3⁺CD56⁺ NKT样细胞成为优势群体，占总细胞数的约85%，扩增倍数达到约43,000倍。与传统的细胞因子诱导杀伤（CIK）细胞相比，TPNC表达更高水平的LFA-1，但在NKp30、NKp44、CXCR4和CXCR6等标记物上存在差异。

体外功能活性

TPNC对多发性骨髓瘤细胞系（IM-9、RPMI-8226）和患者来源的RRMM细胞均表现出显著增强的细胞毒性。在功能上，TPNC显示更高的CD107a表达（脱颗粒标志），以及更强的穿孔素和颗粒酶B产生能力。此外，TPNC在应对肿瘤刺激时分泌更高水平的IFN-γ和TNF-α。

细胞毒性机制

研究发现TPNC主要通过LFA-1和DNAM-1介导的非MHC限制性途径杀伤肿瘤细胞，这些分子的配体（CD112、CD155和ICAM-1/2/3）在MM细胞系和原代RRMM样本上广泛表达。抗体阻断实验证实了这些途径的重要性。有趣的是，虽然HLA-ABC阻断对MM细胞系的杀伤没有影响，但显著降低了TPNC对自体RRMM样本的细胞毒性，表明在自体设置中存在抗原特异性、TCR介导的细胞毒性。

TCR克隆选择

当从CBMC中分离CD3⁺ T细胞并在没有抗原呈递细胞（APC）的情况下培养时，TPNC的细胞毒性功能显著降低，表明APC对于通过TCR依赖性抗原启动获得细胞毒性功能至关重要。TCR测序显示，与第0天的CBMC相比，第21天的TPNC克隆型多样性显著减少，包括更少的独特克隆型、降低的香农多样性和选择性TCR克隆型的优势，表明存在抗原驱动的克隆扩张。

免疫突触形成

活细胞成像显示，TPNC比CIK细胞更快速、更有效地形成免疫突触。TPNC需要更短的时间间隔来实现颗粒极化（T₁）、靶细胞裂解（T₂）和总接触持续时间（T）。此外，TPNC表现出优异的连续杀伤能力，频繁地接触和裂解多个肿瘤靶标。

体内抗肿瘤活性

在异种移植小鼠模型中，TPNC治疗显著降低了肿瘤负荷，并延长了生存期。在 disseminated 模型中，TPNC处理的小鼠在周5时表现出显著降低的肿瘤负荷。在皮下模型中，TPNC处理导致肿瘤生长显著抑制，最终肿瘤重量减少，甚至在一些小鼠中观察到完全肿瘤消退。重要的是，TPNC在周5时仍在外周血中可检测到，表明其具有优异的体内持久性。

安全性评估

安全性评估显示，TPNC没有引起移植物抗宿主病（GvHD）样症状，组织学分析显示主要器官没有损伤或炎症迹象。此外，TPNC对自体PBMC和同种异体CBMC没有细胞毒性效应，表明其对正常免疫细胞没有攻击性。

对其他血液恶性肿瘤的细胞毒性

研究还将TPNC生成策略扩展到ALL和AML，发现TPNC对白血病细胞系和原代白血病细胞均具有强大的细胞毒性。值得注意的是，TPNC对患者来源的ALL细胞的细胞毒性与抗CD19 CAR-NK细胞相当，甚至在某些情况下更优，尽管没有进行基因工程修饰。

研究表明，TPNC代表了一种新型细胞毒性淋巴细胞产品，通过肿瘤驱动的启动而产生。它们的双重识别能力、功能多样性和良好的安全性特征突出了它们作为血液恶性肿瘤可扩展和个性化免疫治疗平台的潜力。与需要基因修饰的CAR-T细胞相比，TPNC提供了一种更安全、更易获得的替代方案。它们能够针对多种血液恶性肿瘤，而无需抗原特异性遗传修饰，使其成为有前途的现成免疫治疗选择。

这项研究的发现支持进一步开发TPNC作为复发难治性血液恶性肿瘤的临床治疗选择。未来的研究应着重于识别TPNC识别的特定肿瘤抗原，优化制造过程，并在更广泛的临床前模型和最终的人体临床试验中评估其安全性和有效性。