新型非侵入性PHP.eB AAV载体靶向α-突触核蛋白治疗帕金森病的在体验证

　　本研究针对帕金森病α-突触核蛋白(aSyn)异常聚集的核心病理机制，通过系统性注射新型脑靶向AAV-PHP.eB载体递送shRNA/miRNA靶向敲低内源性小鼠Snca基因。研究证实该策略可显著降低黑质多巴胺能神经元内aSyn蛋白负荷，有效抑制人源aSyn预形成纤维体(PFF)诱导的pSer129-aSyn病理播散，改善黑质纹状体退变和相关运动缺陷，为广泛病理分布的突触核蛋白病提供了非侵入性基因治疗新思路。

　　

帕金森病作为第二大神经退行性疾病，其典型病理特征是中脑黑质多巴胺能神经元的进行性丢失以及细胞内路易体的形成。这些蛋白包涵体的主要成分是异常聚集的α-突触核蛋白(aSyn)，该蛋白的错误折叠和播散被认为是驱动疾病进展的核心机制。随着全球老龄化进程加速，帕金森病的患病率持续攀升，预计到2040年将影响约1200万人，给社会带来沉重负担。现有治疗方法主要针对症状缓解，无法阻止疾病进展，因此开发针对病因的治疗策略迫在眉睫。

近年来，研究人员将目光聚焦在降低aSyn蛋白水平这一治疗策略上。研究表明，aSyn蛋白负荷与病理播散密切相关，但完全敲除aSyn可能引起神经毒性副作用，如何实现安全有效的靶向调控成为关键科学问题。与此同时，基因治疗载体递送效率低下、血脑屏障穿透能力有限等问题也制约着治疗策略的临床转化。

在此背景下，Maria Fouka等研究者在《Acta Neuropathologica Communications》发表了创新性研究成果。该研究采用新型脑穿透性AAV-PHP.eB病毒载体，通过静脉注射方式递送靶向小鼠Snca基因的shRNA或miRNA序列，系统评估了降低内源性aSyn蛋白负荷对aSyn预形成纤维体(PFF)小鼠模型的治疗潜力。

研究主要采用以下关键技术方法：通过体外原代皮层神经元培养验证AAV介导的Snca敲低效率；使用PHP.eB血清型AAV载体携带GFP报告基因和Snca靶向序列，经静脉注射实现中枢神经系统广泛转导；通过立体定位注射人源aSyn PFFs建立病理播散模型；采用免疫组化、免疫荧光、立体学计数等技术评估病理变化和神经元存活情况；通过挑战性横梁测试和旋转棒实验评估运动功能。

研究结果首先证实了AAV载体在体内的分布和转导效率。如图4所示，静脉注射PHP.eB AAVs三个月后，在整个大脑中实现了广泛的病毒转导，特别是在嗅球 glomerular layer（30-50%转导效率）、前嗅核（15-20%）、前额叶皮层（约30%）和海马CA2区（约45%）等区域观察到显著的神经元转导。重要的是，在黑质区域，约30-44%的多巴胺能神经元被成功转导（图5A-B）。

Snca靶向载体的有效性在蛋白水平得到验证。在转导的GFP⁺/TH⁺多巴胺能神经元中，sh-aSyn和miR-aSyn AAV分别使内源性aSyn蛋白水平降低48%和63%（图5C-E）。这种敲低效果在PFF注射后仍保持稳定，为后续病理研究奠定了基础。

在病理分析方面，研究发现在纹状体内注射人源aSyn PFFs 2.5个月后，注射侧纹状体出现明显的pSer129-aSyn⁺包涵体（图2A-B），同时多巴胺转运体(DAT)荧光强度和酪氨酸羟化酶(TH)⁺纤维密度显著降低（图2C-F），表明纹状体多巴胺能末梢受损。值得注意的是，pSer129-aSyn⁺面积与DAT强度呈负相关（图2D），提示病理负担与神经退变密切相关。

在黑质区域，PFF注射同样诱导了显著的pSer129-aSyn⁺病理聚集（图3A-B），并导致约18%的黑质致密部(SNpc)多巴胺能神经元丢失（图3C-D）。行为学检测显示，PFF注射组小鼠在挑战性横梁测试中出现更多错误步数（图3F），表明运动功能受损。

最关键的研究发现是，AAV-PHP.eB介导的内源性aSyn敲低显著减轻了PFF诱导的病理变化。在黑质区域，miR-aSyn处理使pSer129-aSyn⁺面积在SNpc和SNpr都显著减少（图6E-F），而sh-aSyn处理也显示了减少趋势。在纹状体，miR-aSyn处理组的pSer129-aSyn⁺面积显著降低（图6I），且与TH光学密度呈负相关（图6J）。

更重要的是，aSyn敲低带来了神经保护效应。立体学计数显示，miR-aSyn处理显著减轻了PFF诱导的黑质TH⁺神经元丢失（图7B）。纹状体TH⁺纤维密度的分析也证实了类似的保护趋势（图7D-E）。这些结构改善与功能恢复相一致：aSyn敲低组小鼠在挑战性横梁测试（图7F-G）和旋转棒实验（图7H）中都表现出运动功能的显著改善。

研究还发现，aSyn敲低不仅减轻了注射局部的病理变化，还抑制了病理向其他脑区的播散。在前额叶皮层、海马、皮层和杏仁核等与纹状体有连接的区域，sh-aSyn和miR-aSyn处理都减少了pSer129-aSyn⁺病理面积（图8B-I），表明内源性aSyn敲低能够有效抑制病理的跨突触传播。

研究结论强调，通过系统性注射AAV-PHP.eB载体实现的内源性aSyn敲低，能够有效减轻PFF诱导的aSyn病理播散、保护多巴胺能神经元、改善运动功能，且不引起明显毒性反应。这些发现进一步证实了细胞内aSyn蛋白负荷在病理播散中的关键作用，并为治疗广泛病理分布的神经退行性疾病（如突触核蛋白病）提供了非侵入性基因递送策略的重要概念验证。

该研究的创新性在于首次将新型AAV-PHP.eB载体与aSyn靶向基因治疗策略相结合，通过非侵入性静脉注射实现了中枢神经系统的广泛转导和有效基因敲低。研究采用的PFF模型能更好地模拟人类帕金森病的病理播散特征，使研究结果具有更高的临床相关性。研究同时比较了shRNA和miRNA两种敲低策略的效果，为后续治疗开发提供了重要参考。

然而，研究也存在一些局限性，如PHP.eB载体利用LY6A受体穿过血脑屏障的机制在小鼠中特异，在人类中可能需要替代策略；部分实验组的样本量较小，影响了统计效力；长期效应和安全性仍需进一步验证。尽管如此，这项研究为开发针对突触核蛋白病的非侵入性基因治疗奠定了坚实基础，代表了该领域的重要进展。