基于3D多细胞支架的模型在推进骨骼疾病研究中的应用

《Advanced Functional Materials》：3D Multicellular Scaffold Based Model for Advancing Bone Disorder Research

　　骨组织工程与疾病模型构建。摘要：本研究开发了一种包含成骨细胞、破骨细胞和内皮细胞的3D多细胞骨模型，利用生物相容性可降解支架实现骨形成、吸收及血管化的动态平衡。实验证实该模型能准确模拟骨矿化、微血管形成及TRAP阳性破骨细胞活动，并成功构建骨软化症（OI）疾病模型，显示Col1a1表达降低和异常骨矿化特征。该模型突破了传统2D培养和动物模型的局限，为骨生理研究、疾病机制探索及药物筛选提供了新型平台。

　　随着人类寿命的延长，骨骼研究的重要性日益凸显。骨骼病理问题往往由年龄相关的退化与遗传、营养或激素调控失衡共同导致。目前，骨骼研究主要依赖于二维细胞培养和动物模型，然而这些方法在模拟体内复杂环境方面存在明显局限。为了更好地再现骨骼的生理与病理特征，研究人员正在探索三维组织工程模型。然而，现有的三维模型在细胞复杂性、血管化以及组织成熟度等方面仍难以达到体内骨骼的水平。本文介绍了一种新的复合多细胞三维模型，该模型整合了成骨细胞、破骨细胞和内皮细胞，培养在一种生物相容性且可降解的支架上，从而在可控条件下再现骨骼形成、吸收和血管化过程。这些组织构建体在组织学、分子和功能层面都显示出骨骼矿化、微血管形成以及TRAP（酒石酸盐抗性酸性磷酸酶）阳性的破骨细胞活性，表明其具备良好的生理模拟能力。通过将该系统应用于成骨不全症（OI）的研究，揭示了该疾病的一些病理特征，如I型胶原蛋白α1链（COL1A1）表达减少和基质过度矿化。这种模型克服了传统二维培养和动物模型的局限性，使得在人类相关的背景下直接研究细胞-细胞和细胞-基质之间的动态相互作用成为可能。此外，该模型能够再现原生骨骼组织的结构和功能组织，为骨骼生理学、疾病建模和药物筛选提供了一个强大且可扩展的平台。

骨骼作为人体的基本器官之一，不仅为内脏器官提供保护，还是钙质储存库，参与红细胞生成，并支持运动功能。骨骼的最小单位是骨多细胞单位（BMU），其中包含了成骨细胞、骨细胞、破骨细胞以及血管等关键结构。骨重塑是一个复杂的多步骤过程，包括静止期、激活期、吸收期、形成期以及最终的矿化期。在骨形成初期，成骨细胞会沉积I型胶原蛋白和矿物质，形成称为骨样组织的骨前体结构。随着成骨细胞的成熟，它们会转变为骨细胞，嵌入新形成的骨基质中，作为机械感受器，监测骨骼的变化，并通过信号传导机制调控骨形成或吸收。当检测到微骨折时，骨细胞和成骨细胞会分泌RANKL，激活单核细胞分化为多核的破骨细胞，进而吸收骨组织。一旦吸收完成，破骨细胞发生凋亡，而成骨细胞和衬里细胞被激活以启动新的骨形成。在骨重塑过程中，成骨细胞的形成与破骨细胞的吸收之间的平衡至关重要，任何失衡都会导致骨重塑过程的脱耦，进而影响骨骼的完整性，引发各种骨骼疾病，包括骨质疏松症和遗传性骨骼疾病，如成骨不全症、 cherubism、melorheostosis和osteopetrosis等。

为了研究这些骨骼疾病，科学家们通常采用二维培养和小型动物模型，例如小鼠、大鼠、斑马鱼等。然而，二维培养无法准确模拟整体组织及其动态过程，而动物模型在再现人类疾病方面也存在局限。近年来，多细胞三维培养技术被引入，以更贴近体内环境的方式研究细胞间的相互作用。许多研究小组已经发表了三维骨培养模型，但大多数仅包含单一细胞类型（如成骨细胞或破骨细胞）或成骨细胞与破骨细胞的共培养。只有少数研究引入了多细胞三维培养系统。尽管多细胞三维模型具有巨大潜力，但在培养基组成、细胞比例、细胞来源、合适的评估时间点以及细胞间接触方式等方面仍存在技术挑战，这些限制了其在可重复性和可扩展性方面的应用。

为了解决这些问题，研究人员开发了一种生物准确、稳定且可扩展的三维体外多细胞骨模型。该模型不仅适用于人类和小鼠细胞，还特别设计用于研究成骨不全症等特定疾病的机制。通过将血管组织与成骨细胞和破骨细胞相结合，该模型更精确地再现了骨微环境。研究人员对这些模型进行了测试，评估其在骨骼形成、基质构建、血管生成和骨吸收方面的潜力。通过多种方法，包括流变学、矿化、组织学、微CT（μCT）以及针对成骨细胞、破骨细胞和内皮细胞分化的关键转录因子和蛋白的全组织免疫荧光染色，对模型进行了全面评估。

在实验部分，研究人员首先对细胞培养进行了详细描述。用于研究的人类细胞包括脂肪间充质干细胞（ADMSC）和人脐静脉内皮细胞（HUVEC），以及THP-1细胞（用于破骨细胞分化）。这些细胞在特定培养基中进行培养，以确保其在三维支架上的有效附着和分化。同时，用于研究的小鼠细胞包括颅骨成骨细胞、胰腺内皮细胞和骨髓单核细胞，这些细胞在特定的分化条件下被诱导为破骨细胞。在支架制备方面，研究人员采用了两种方法：牺牲模具法和盐渗法。通过计算机辅助设计，研究人员创建了具有不同结构和孔隙率的支架，并通过3D打印技术进行制造。牺牲模具法利用了可溶性材料制作模具，随后将其移除以形成支架结构。盐渗法则是通过将盐颗粒加入聚合物溶液中，再通过水洗去除盐，从而形成高孔隙率的支架结构，为细胞提供更良好的生长环境。

在细胞接种过程中，研究人员对支架进行了预处理，包括浸泡于70%乙醇和PBS洗涤，以确保支架表面的清洁。随后，将人类或小鼠的细胞按照特定比例接种到支架上，并在培养基中加入骨生成相关的成分，以促进细胞分化。在骨生成阶段，细胞在支架上形成基质和矿化结构；随后，破骨细胞被引入并被分化为具有活性的破骨细胞。这些细胞在支架上进行骨吸收，并在后期被观察到具有TRAP活性，表明其成功分化为功能性破骨细胞。

在矿化染色方面，研究人员使用了Alizarin Red S染色，以可视化矿化情况。通过将支架浸泡在特定pH值的乙醇溶液中，并在室温下进行染色，成功检测到了矿化沉积。随后，通过测量染色液的光密度，评估矿化程度。在组织学分析中，研究人员使用了H&E、Masson三色染色、Safranin O染色以及TRAP和ALP染色，以进一步确认骨骼的形成和破骨细胞的活性。此外，对细胞分化标志物如Runx2、CD31、Spp1、Dmp1、Col1a1和Osteonectin进行了免疫荧光染色，以验证细胞在不同阶段的分化情况。

在机械性能测试方面，研究人员使用了流变仪对不同支架的机械特性进行了评估。结果显示，不同结构的支架在初始阶段表现出不同的机械刚度，其中PLLA/PLGA的gyroid结构和PCL的grid结构具有较高的初始刚度。然而，随着细胞的培养和组织的形成，不同支架的表现也发生了变化。在PCL支架中，机械刚度随时间逐渐增加，表明细胞活动能够增强支架的结构稳定性。相比之下，PLLA/PLGA支架由于其较快的降解特性，机械刚度在两周内明显下降，表明其降解速度超过了细胞构建新组织的能力。盐渗法制造的PLLA/PLGA支架在培养过程中表现出逐渐增加的机械刚度，这可能与其较高的孔隙率和随机纤维结构有关，这些结构促进了营养物质的扩散和细胞的浸润，从而增强了骨生成的效率。

在微CT扫描方面，研究人员对支架的结构进行了高分辨率成像，以评估其内部的矿化和血管化情况。扫描结果显示，盐渗法支架在培养过程中表现出逐渐增加的矿化和血管形成，表明其能够支持骨骼和血管组织的同步发展。同时，研究人员还使用了AngioTool软件对血管结构进行了分析，进一步验证了支架的血管化能力。

在疾病建模方面，研究人员使用了携带COL1A2 G610C突变的成骨不全症小鼠模型，以评估其在三维多细胞模型中的表现。结果显示，这些突变细胞在支架上形成了更多的矿化结构，并表现出更高的血管形成能力。同时，COL1A1的表达水平降低，表明该模型能够再现成骨不全症的病理特征。此外，破骨细胞的活性和数量也有所增加，这与成骨不全症患者中常见的高骨重塑率一致。这些结果表明，该三维模型能够有效模拟成骨不全症的病理特征，从而为研究该疾病提供了重要的工具。

在讨论部分，研究人员强调了三维多细胞模型在骨骼研究中的重要性。相比于传统的二维培养和动物模型，这种模型能够更准确地再现骨骼的生理和病理过程。此外，研究还指出，不同支架材料和结构对骨骼形成和矿化具有重要影响。例如，PLLA/PLGA支架由于其较高的孔隙率和随机纤维结构，能够促进细胞的渗透和矿化，而牺牲模具法制造的支架则可能由于结构的有序性而限制了细胞的动态活动。因此，选择合适的支架材料和结构对于构建功能性的三维骨模型至关重要。

研究人员还提到，血管化在骨骼的生存、发育、重塑和维持中起着关键作用。血管生成与骨生成过程紧密相关，特定的血管网络能够通过旁分泌信号促进骨修复，并招募成骨细胞和间充质细胞至骨折部位。在本研究中，三维模型中形成了复杂的血管网络，表明内皮细胞在体外环境中能够成功分化并形成血管结构。同时，研究还指出，RUNX2作为成骨细胞分化的重要调控因子，能够影响多个相关蛋白的表达，如IBSP、SP7、骨钙素（BGLAP）和SPP1。这些蛋白的表达水平在三维模型中得到了验证，表明成骨细胞能够有效完成其分化过程。

此外，研究还探讨了三维模型在疾病建模中的应用。通过引入成骨不全症相关的突变细胞，研究人员能够观察到该疾病在三维环境中的表现，包括COL1A1表达的减少和基质过度矿化。这些发现不仅验证了模型的有效性，还表明该平台具有再现疾病表型的能力，可用于研究疾病机制和评估治疗干预的效果。

在结论部分，研究人员指出，所建立的三维多细胞骨模型能够模拟多种骨骼特性，并为研究基础生物学、临床问题和疾病机制提供了一个有价值的平台。未来，这些模型有望用于大规模药物筛选，为个性化医学提供支持。通过整合机械刺激、灌注系统和免疫细胞成分，该模型的生理相关性将进一步提高，从而在转化医学中发挥更大的作用。