靶向蛋白质损伤应答：克服癌症多药耐药的新策略——抑制蛋白酶体活性逆转乳腺癌与结肠癌耐药性

　　本研究揭示抗癌药物在作用于经典靶点前会广泛破坏新合成蛋白质，诱导线粒体活性氧（mtROS）正反馈循环，从而激活蛋白质损伤应答（PDR）。团队通过大规模药物筛选、蛋白质组学及临床样本验证，发现耐药患者蛋白酶体活性显著升高，并开发高灵敏度检测试剂盒。利用3D肿瘤切片培养模型及临床试验证实，蛋白酶体抑制剂可有效逆转高蛋白酶体活性患者的耐药性，为预测及克服多药耐药（MDR）提供了新策略。

　　

癌症治疗中多药耐药（Multidrug Resistance, MDR）是导致患者死亡的主要原因之一，其机制复杂且尚未完全阐明。传统观点认为耐药性主要源于DNA损伤修复、药物外排泵激活或靶点突变等因素，但越来越多证据表明蛋白质稳态失衡可能在其中扮演关键角色。尽管前期研究发现蛋白酶体活性与耐药性存在关联，但抗癌药物如何引发蛋白质损伤、细胞如何应对这种损伤以及该过程与MDR的形成有何联系，仍是一系列悬而未决的重要问题。

为解决这些问题，研究人员开展了系统性探索。他们首先通过101种FDA批准抗癌药物的大规模筛选，发现87%的药物在1小时内即可诱导蛋白质错误折叠和聚集。进一步机制研究表明，这些药物可非特异性结合新合成蛋白质（尤其是线粒体相关蛋白），导致其结构改变和功能丧失，并触发线粒体活性氧（mtROS）大量生成，形成加剧蛋白质损伤的正反馈循环。作为应对，癌细胞迅速启动蛋白质损伤应答（Protein Damage Response, PDR），通过泛素-蛋白酶体系统识别和清除受损蛋白质。团队发现晚期耐药性乳腺癌和结肠癌患者组织中蛋白酶体活性显著升高，据此开发了可检测微量临床样本的蛋白酶体活性检测试剂盒。通过三维肿瘤切片培养（3D-TSC）模型和研究者发起的临床试验，他们证实三种临床批准的蛋白酶体抑制剂（Bortezomib, Carfilzomib, Ixazomib）可有效逆转高蛋白酶体活性患者的耐药性。

研究主要采用了以下关键技术方法：

1. 1.
   大规模药物筛选与PROTEOSTAT蛋白质聚集检测；
2. 2.
   生物素标记药物pull-down结合质谱分析（CIS-biotin MS）；
3. 3.
   有限蛋白酶解耦合质谱（LiP-MS）在全蛋白质组范围鉴定药物结合位点；
4. 4.
   泛素化修饰组学分析；
5. 5.
   临床样本来源于乳腺癌和结肠癌患者队列，通过蛋白酶体活性检测试剂盒进行分型；
6. 6.
   3D肿瘤切片培养（3D-TSC）进行药物敏感性测试；
7. 7.
   体内外模型验证蛋白酶体抑制剂的耐药逆转效应。

The vast majority of anticancer drugs induce a wide range of protein damage

研究人员通过101种抗癌药物处理MDA-MB-231细胞，发现87%的药物在1小时内引起蛋白质聚集，其中19%诱导强聚集。铂类药物Cisplatin（CIS）和激酶抑制剂Lapatinib（LAP）均可在30-60分钟内引发聚集，12小时后被清除。蛋白质氧化损伤检测显示34种药物处理8小时后均诱导不同程度羰基化。CIS-biotin pull-down实验证实CIS可直接结合287种蛋白质，蛋白酶体抑制剂Bortezomib（BTZ）处理后结合蛋白增至865种，且线粒体代谢和蛋白酶体相关通路显著富集。LiP-MS分析进一步揭示CIS引起414种蛋白质结构改变，主要影响线粒体功能和蛋白酶体通路。

Anticancer drugs damage neosynthesized proteins and their functions

蛋白质合成抑制剂Cycloheximide（CHX）可完全阻断多种药物诱导的K48多聚泛素化（K48 polyUB），而Puromycin（Puro）通过提前终止肽链合成加剧损伤。利用Dox诱导系统验证显示，LAP仅损伤新合成蛋白质（如HA-NOTCH1、Myc-PARKIN、FLAG-Cas9），对成熟蛋白质无影响。CHX处理显著减少CIS结合蛋白数量（从287降至86），并完全抑制蛋白质聚集和泛素化。线粒体靶向GFP（MTS-GFP）荧光强度和丙酮酸脱氢酶（PDH）活性实验证实药物处理损害新合成蛋白质功能。

Anticancer drugs damage neosynthesized proteins prior to the generation of mitochondrial ROS, which in turn enhances protein damage

23种药物筛选显示17种诱导mtROS生成，但蛋白质损伤发生于用药后10分钟，而mtROS在8-12小时才出现。MitoQ（mtROS抑制剂）部分阻断蛋白质损伤，CHX则完全抑制。复合呼吸链蛋白损伤导致mtROS爆发，而BTZ加剧损伤后mtROS进一步增加，Puro处理则完全消除mtROS。时间进程显示泛素化在1小时出现，蛋白质羰基化在8小时出现，表明药物先损伤蛋白质再诱发mtROS正反馈循环。

Anticancer drug treatment triggers a ubiquitin-proteasome-dependent PDR

101种药物中77%在1小时内诱导K48 polyUB，6小时后升至87%。泛素化组学鉴定出CIS处理下669种蛋白质泛素化水平升高（log₂FC>3），富集于线粒体代谢和蛋白酶体通路。E1酶抑制剂TAK-243完全抑制泛素化，BTZ则导致泛素化积累和Caspase 3激活。时间进程显示CIS处理1小时发生蛋白质损伤，DNA损伤（γH2AX）数小时后出现。体内实验表明肿瘤中蛋白质损伤24小时达峰后逐渐清除，DNA损伤48小时出现，BTZ处理使两者持续积累。EGFR抑制剂Neratinib（NER）和Dacomitinib（DMT）均在2小时引发蛋白质损伤，6小时才抑制EGFR/AKT通路并诱导DNA损伤。对比CIS/DOB（诱导DNA损伤）与LAP/Gefitinib（GEF，不诱导DNA损伤）发现，所有药物均1小时内触发PDR，但仅前者激活DNA损伤应答（DDR）。

Inhibition of the PDR triggers cell death

CHX处理抑制CIS诱导的Caspase 3激活。TAK-243或BTZ处理均加剧LAP/CIS引起的蛋白质聚集和细胞死亡。shRNA敲低PSMB5/7同样增强损伤积累。在5种乳腺癌细胞中，BTZ与LAP联用显著协同抑制HER2阳性及耐药株（JIMT-1）生长。研究表明PDR通过泛素化识别和蛋白酶体清除保护细胞，抑制任一环节均加速死亡。

Proteasome activity is associated with malignancy and serves as a prediction marker for MDR

TCGA/TARGET多癌种分析显示蛋白酶体活性在肿瘤和转移灶中升高。65例乳腺癌患者检测证实三阴性乳腺癌（TNBC）和晚期（III-IV期）患者活性最高。25例治疗随访中进展（PD）患者蛋白酶体活性显著高于部分缓解（PR）或稳定（SD）患者。结肠癌患者同样显示晚期活性升高，58例IV期患者中PD组活性更高。TCGA队列中卡培他滨/贝伐珠单抗耐药者蛋白酶体活性评分显著高于敏感者。动物实验证实Carfilzomib（CFZ）联合CIS抑制231-R3耐药瘤生长，伴随K48 polyUB积累和蛋白酶体活性抑制。3D-TSC模型显示高蛋白酶体活性患者对卡培他滨（CAP）/Epirubicin（EPR）及紫杉类耐药，BTZ联用可逆转。临床试验中蛋白酶体活性最高（136.3 nmol AMC/min/μL/g）的乳腺癌患者P115，经Ixazomib（IXA）联合吉西他滨（GEM）治疗1个月后病灶显著缩小。

该研究首次系统阐明抗癌药物通过广泛损伤新合成蛋白质触发PDR是MDR的核心机制。蛋白酶体活性升高成为耐药性的生物标志物，抑制该通路可有效逆转耐药。研究不仅为理解药物毒性提供了新视角，更为临床预测和克服MDR提供了检测手段和治疗策略，尤其适用于晚期乳腺癌和结肠癌患者。