基于precisION算法的天然拓扑质谱技术揭示隐藏蛋白质修饰的突破性研究

　　本研究针对天然拓扑质谱（nTDMS）在解析蛋白质复合物修饰时存在的技术瓶颈，开发了创新型软件precisION。该工具通过数据驱动的碎片级开放搜索策略，成功在PDE6、ACE2、SPP1和GAT1等治疗相关靶点上发现了未被记录的磷酸化、糖基化和脂质化修饰，并破解了GAT1冷冻电镜图谱中此前无法解析的密度区域。这项研究为整合结构生物学和药物研发提供了强大工具。

　　

在生命科学领域，蛋白质翻译后修饰（PTM）如同精密的分子开关，调控着几乎所有细胞过程。然而，传统的质谱分析方法往往需要将蛋白质变性或酶解，这就像为了研究一幅油画的细节而不得不将其切割成碎片——虽然能识别颜料成分，却失去了整体构图和笔触关联的关键信息。特别是在研究具有复杂修饰的蛋白质复合物时，这种局限性更加明显：低丰度修饰、未知修饰以及多种修饰共存产生的异质性，使得科学家们难以在天然结构状态下全面捕捉蛋白质的真实形态。

面对这一挑战，牛津大学化学系的Jack L. Bennett研究团队在《Nature Methods》上发表了突破性研究成果。他们开发了名为precisION（precise and accurate Identification Of Native proteoforms）的交互式端到端软件包，通过创新的数据驱动碎片级开放搜索策略，实现了对完整蛋白质复合物中"隐藏修饰"的精准检测、定位和定量。

为开展本研究，团队运用了多项关键技术：首先采用高分辨率天然拓扑质谱（nTDMS）技术分析蛋白质复合物；利用改进的Richardson-Lucy算法进行光谱去卷积；通过机器学习辅助的同位素包络分类技术区分真实信号与噪声；开发了碎片级开放搜索算法识别未知修饰；结合冷冻电镜（cryoEM）数据进行结构验证。研究样本包括从牛视网膜外段膜分离的内源性PDE6复合物、HEK293细胞表达的重组人ACE2和SPP1，以及通过慢病毒转染在HEK293S GNTI^-/-细胞中稳定表达的人GAT1 transporter。

揭示ACE2受体的糖基化图谱

研究人员首先将precisION应用于具有复杂糖基化模式的人血管紧张素转换酶2（ACE2）受体。即使在糖基化工程改造的HEK293 GNTI^-/-细胞中（所有N-糖均具有固定Man₅GlcNAc₂组成），ACE2二聚体仍显示出意想不到的异质性。通过precisION分析，团队发现了ACE2 C末端的可变蛋白水解加工，并成功定位了N-糖基化位点。特别值得注意的是，研究人员观察到Hex₅HexNAc₂和单个HexNAc修饰的序列离子，这些离子来自于碰撞激活过程中完整聚糖的部分分解。

解析信号糖蛋白SPP1的深层修饰

分泌磷蛋白1（SPP1或骨桥蛋白）是细胞外基质中的关键信号因子，经历复杂的翻译后加工过程。研究人员发现，在厚重的O-糖基化"涂层"之下，SPP1存在着以前未被发现的截短变体和磷酸化修饰。通过多缺口碎片级开放搜索，precisION识别出两个主要的C末端截短（Tyr246|Lys和Glu197|Leu），这些切割位点与已知的凝血酶切割位点不一致，暗示着新的蛋白水解调控机制。更重要的是，研究团队量化了整个蛋白质长度上的磷酸化水平，发现平均每个SPP1分子仅携带约0.6个磷酸基团，主要位于Asn59至Glu80区域。

发现GAT1转运蛋白的多样化脂质修饰

对于γ-氨基丁酸（GABA）转运蛋白1（GAT1/SLC6A1），precisION揭示了其复杂的脂质修饰模式。除了预期的三糖基化形式外，研究人员还发现了两种主要修饰形式：+238 Da和+265.5 Da质量偏移，分别对应棕榈酰化和硬脂酰化。通过高精度质谱分析，团队区分了16:0、18:1和18:0脂肪酸修饰，并将其定位于Cys493和Cys499之间的短肽段。特别令人兴奋的是，当研究人员重新检查GAT1-配体复合物的高分辨率冷冻电镜图谱时，发现从Cys493延伸出的未分配密度恰好可以容纳precisION发现的棕榈酸基团。这一发现不仅确认了修饰位点，还揭示了脂质修饰可能通过阻断胆固醇相互作用来调节GAT1功能的潜在机制。

研究结论与意义

precisION的开发标志着天然拓扑质谱分析进入了新纪元。该平台通过几个创新性设计解决了nTDMS分析中的核心挑战：机器学习辅助的包络过滤最大程度保留了真实碎片离子；分层分配策略确保了碎片的准确注释；特别是碎片级开放搜索模块，能够无偏性地发现未知修饰，而不依赖于现有的蛋白质修饰数据库。

这项研究的深远意义在于：首先，precisION能够直接连接蛋白质修饰与相互作用之间的关系，为理解PTM如何调控蛋白质功能和复合物组装提供了强大工具；其次，该方法特别适用于膜蛋白等难以纯化的蛋白质系统，为膜蛋白生物学研究开辟了新途径；最后，作为开源软件平台，precisION将使研究社区能够充分利用天然拓扑质谱的潜力，推动整合结构生物学、分子病理学和药物研发领域的创新发现。

随着precisION的广泛应用，科学家们将能够更全面地揭示蛋白质修饰组的复杂性，深入理解疾病状态下蛋白质修饰的变化，最终为精准医疗和药物开发提供新的分子洞察和靶点发现途径。