刺果毛茛叶绿体全基因组解析：揭示其基因组特征与系统发育进化关系

　　本研究报告了药用植物刺果毛茛（Ranunculus muricatus）的首个完整叶绿体基因组（cpDNA），揭示了其155,129 bp的四分体结构（GC含量37.9%）及126个功能基因。研究通过系统发育分析确认该物种与R. repens共同聚类于Polyanthemos组，为毛茛属物种鉴定、遗传多样性及进化关系研究提供了关键基因组学基础。

　　

Abstract

刺果毛茛（Ranunculus muricatus L. 1753）是一种广泛分布的药用植物，俗称刺果毛茛。本研究首次报道了该物种的完整叶绿体基因组。基因组呈现典型的四分体结构，全长155,129 bp（LSC区84,636 bp；SSC区18,909 bp；IR区各25,792 bp），GC含量为37.9%。共注释到126个功能基因，包括81个蛋白质编码基因、37个tRNA基因和8个rRNA基因。系统发育分析显示，刺果毛茛与R. repens在Polyanthemos组内形成一个单系群。这些发现为其物种鉴定、遗传多样性和系统发育进化研究提供了支持。

Introduction

刺果毛茛在亚洲、澳大利亚、南美和欧洲广泛分布，是植物学和药理学研究的重要对象。传统上它被用于治疗咳嗽、哮喘等呼吸系统疾病以及湿疹、癣菌感染等皮肤问题。现代研究证实其具有显著的抗氧化活性，含有muricazine等化合物，并表现出对乙酰胆碱酯酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性，以及抗炎和抗多种癌细胞系的细胞毒特性。尽管已有大量植物化学研究，但针对刺果毛茛的基因组研究仍然有限。对其叶绿体基因组的研究可为进化关系、遗传适应等提供重要见解。

Materials and methods

研究样本采集自中国山东省菏泽市牡丹区（115.456555°E, 35.271757°N），凭证标本保存在菏泽大学植物标本馆（ accession number HZ20250103）。采用CTAB法提取总基因组DNA，使用Hieff NGS^? OnePot Pro DNA Library Prep Kit V4构建测序文库，并在DNBSEQ平台上进行150 bp双端测序。使用Fastp（v0.21.0）过滤原始读数，去除含>5% N碱基、≥50%低质量碱基（Q≤5）、接头污染或PCR重复的读数。通过GetOrganelle（v1.7.1）组装完整叶绿体基因组，参数设置为“-R 50 -k 21,45,65,85,105 -P 1000000 -F embplant_pt”。使用在线工具CPGAVAS2（参考数据集“43-plastomes”）进行注释，并通过Apollo（v1.11.6）手动调整。最终注释的叶绿体基因组提交至GenBank（ accession number PV744414）。利用在线工具CPGview展示环状基因组图谱，使用DrawSeqDepth计算测序深度和覆盖图。

为分析刺果毛茛的系统发育位置，从Ranunculus和Auricomus亚属（根据H?randl和Emadzade建立的分类框架）检索了叶绿体基因组。数据集包括19个毛茛属物种（不包括本研究中的刺果毛茛）和两个外群（S. hexandrum和B. oiwakensis）。从22个叶绿体基因组中提取了64个共享蛋白质编码基因。使用MAFFT（v7.505）进行序列比对，并通过IQ-TREE（v2.2.2.7）采用GTR+F+R2模型和1,000次bootstrap重复构建最大似然（ML）系统发育树。

Results

经过质量过滤和预处理，获得了至少22 Gb的全基因组测序数据（fastq格式）。这些高质量读数用于组装高质量叶绿体基因组。刺果毛茛叶绿体基因组序列全长155,129 bp，呈现典型的四分体结构。组装的完整叶绿体基因组平均测序深度为1698.32×，最小深度182×，最大深度2298×。基因组包括两个IR区，各长25,792 bp，被一个84,636 bp的LSC区和一个18,909 bp的SSC区分开。

叶绿体基因组显示出典型的四分体结构，包括一个大单拷贝（LSC）区、一个小单拷贝（SSC）区和一对反向重复序列（IRa和IRb）。基因按功能类别着色，并分布在基因组的两条链上。内部灰色环表示整个基因组的GC含量。功能类别包括参与光系统I和II、细胞色素b6/f复合物、ATP合酶、NADH脱氢酶、RNA聚合酶、核糖体蛋白（小亚基和大亚基）、Rubisco、tRNA、rRNA和假设的叶绿体阅读框（ycf）的基因。

刺果毛茛叶绿体基因组注释识别出126个基因（109个独特基因），包括81个蛋白质编码基因（75个是独特的）、8个rRNA基因（4个是独特的）和37个tRNA基因（30个是独特的）。此外，基因组包含一个反式剪接基因（rps12）和22个（18个是独特的）顺式剪接基因（14个蛋白质编码基因和8个tRNA基因）。反式剪接基因rps12在两个IR区各有一个3′尾巴，每个含有一个内含子。除rps12外，19个基因有一个内含子，三个基因有两个内含子。叶绿体基因组显示出不同的GC含量分布，总GC含量为37.9%。IR区的GC含量最高（43.5%），而LSC和SSC区的相应值分别为36.0%和31.0%。

系统发育分析显示，毛茛属物种明显分为两个主要支系，对应Ranunculus和Auricomus亚属，与H?randl和Emadzade建立的分类框架一致。在Ranunculus亚属内，识别出一个高支持度的单系群，即Polyanthemos组，包括R. cantoniensis、R. silerifolius var. silerifolius、R. chinensis、刺果毛茛和R. repens。值得注意的是，两个刺果毛茛登录号形成一个与R. repens姐妹的独特簇。

Discussion and conclusion

本研究首次报道了刺果毛茛叶绿体基因组的主要特征，其呈现典型的环形四分体结构，大小为155,129 bp，预测有126个基因。系统发育分析显示，刺果毛茛与R. repens形成一个单系群。刺果毛茛表现出典型的四分体叶绿体基因组结构，基因组大小范围从150,820 bp（R. testiculatus）到158,314 bp（R. trichophyllus）。刺果毛茛在毛茛属物种中拥有最小的叶绿体基因补体，仅有126个基因，而典型范围是126个（R. sceleratus）到131个（R. kadzusensis）。

毛茛属是一个分类学上具有挑战性的属，因为存在形态相似的物种，使得物种鉴定困难。一些研究人员认为刺果毛茛应归属于Polyanthemos组。系统发育分析提出了将刺果毛茛纳入Polyanthemos组的建议。我们的系统发育重建强烈支持这一分类，刺果毛茛在Polyanthemos组内形成一个明确界定的单系支系。

由于叶绿体基因组数据稀缺，目前对毛茛属的系统发育理解仍然有限。正如Qiao等人所指出的，稳健的系统发育重建需要整合更多物种的核和细胞器基因组。未来的研究应扩大采样，生成高质量基因组序列，并采用全面的系统发育分析来解决毛茛属复杂的进化关系。

Ethical approval

刺果毛茛标本不是濒危物种，不需要特定许可或执照。对该物种的研究，包括植物材料的收集，均遵循菏泽大学在本研究中提供的指南进行。

Acknowledgments

所有作者均对稿件有贡献。Chunfeng Wan鉴定了物种并收集了样本。Junliu Song主要负责研究设计和资金获取。Qingxia Chen组装并注释了叶绿体基因组。Han Liu分析了叶绿体基因组结构。Hongqin Shang验证了数据，可视化了基因组图谱和基因结构，并起草了手稿。所有作者均批准了最终版本发表，并同意对工作的所有方面负责。

Disclosure statement

作者未报告潜在的利益冲突。

Data availability statement

本研究中刺果毛茛的完整叶绿体基因组序列已提交至NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov），登录号为PV744414。相关的BioProject、BioSample和SRA编号分别为PRJNA1146888、SAMN48789701和SRR33755263。