恶性疟原虫食物泡转运蛋白新突变在K13介导的青蒿素耐药性之外的潜在作用机制研究

　　本综述系统探讨了恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）食物泡（Food Vacuole, FV）转运蛋白的新型突变在青蒿素（ART）及氯喹（CQ）耐药性形成中的协同作用。研究通过蛋白质组学分析鉴定出16种FV转运蛋白，并结合突变共现分析与酵母功能互补实验，揭示了PfNT1、PfMFR5等转运蛋白突变与PfKelch13及PfCRT耐药标志物的显著关联，为多药耐药机制提供了新视角。

　　

ABSTRACT

疟疾仍然是全球发病和死亡的主要原因之一，主要归因于当前抗疟药物耐药性的出现。恶性疟原虫食物泡（FV）蛋白，包括氯喹耐药转运蛋白（PfCRT）、PfMDR1以及胞质蛋白PfKelch13，分别与氯喹和青蒿素耐药性相关。本研究旨在鉴定这些耐药标志物与其他FV转运蛋白突变在多个田间分离株中的关联。通过分离完整的恶性疟原虫FVs并进行详细的蛋白质组分析，鉴定了新的FV转运蛋白。此外，利用Pf3K和MalariaGEN数据库的单核苷酸多态性（SNP）数据，对FV富集部分中鉴定的这些转运蛋白与已知的PfKelch13和PfCRT多态性进行了共存突变分析。蛋白质组分析鉴定出16种转运蛋白在疟原虫FVs中。这些转运蛋白的比较氨基酸分析揭示了FV富集部分中鉴定的几种转运蛋白突变与PfKelch13、PfCRT和PfMDR1蛋白突变的共关联。对2517个样本的Pf3K和MalariaGEN数据库SNP数据分析显示，四种转运蛋白基因（PfCRT、PfNT1、PfCTR2和PfMDR2）中的六个突变与PfKelch13多态性共关联（P < 0.0001），表明其他寄生虫转运蛋白对氯喹和青蒿素耐药性进化的贡献。此外，在酿酒酵母中与野生型PfNT1和PfMFR5蛋白及其突变形式（PfNT1-F394L、PfMFR5-S278T和PfMFR5-Y570F）的功能互补实验，在双氢青蒿素存在下导致突变表型耐药，表明这些突变在获得耐药性中的可能作用。总之，田间分离株的基因组序列数据和酵母互补分析鉴定了与PfKelch13介导的抗疟耐药相关的新位点，并揭示了转运蛋白对青蒿素耐药性的未探索贡献。

INTRODUCTION

尽管过去二十年疟疾发病率和死亡率显著降低，主要得益于氯喹（CQ）和青蒿素（ART）联合疗法及其他预防措施的合理使用，但2023年疟疾仍导致约2.63亿病例和59.7万死亡。未能完全根除疟疾的主要原因是寄生虫对当前抗疟药物和杀虫剂耐药性的出现。因此，开发新药物以及有效的疟疾疫苗对于根除疟疾至关重要。此外，理解耐药机制对于在药物部署期间进行有效监测至关重要。恶性疟原虫食物泡（FV），也称为消化泡，是一种溶酶体样细胞器，是无性血液阶段发育期间大量代谢活动如血红蛋白（Hb）消化和疟色素（HZ）形成的场所。转录组学、蛋白质组学和相互作用组研究显示，在CQ和ART耐药系中，许多寄生虫通路发生广泛变化。多项研究表明，FV代谢活动，特别是与Hb内吞、蛋白水解和HZ形成相关的活动，在恶性疟原虫对CQ和ART耐药中受到影响。CQ耐药寄生虫表现出FV中CQ积累减少。突变型恶性疟原虫CQ耐药转运蛋白（PfCRT）可以从FV中 efflux CQ，远离其作用位点，而PfMDR1突变可以调节这种耐药水平。类似地，在ART耐药寄生虫中，PfKelch13蛋白突变与Hb摄取和消化减少相关，导致血红素产生减少、ART活化水平降低和细胞应激减少。本研究通过纯化FVs的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析鉴定了FV膜转运蛋白的组成。进行了共存分析以确定PfKelch13和PfCRT蛋白突变与FV富集部分中鉴定的某些转运蛋白突变的关联。此外，对两种先前表征的转运蛋白PfNT1和PfMFR5及其突变体的酵母互补研究为这些突变在ART耐药中的功能提供了证据。总体结果为了解多个FV转运蛋白在抗疟耐药广泛机制中的参与提供了新见解。

RESULTS

Proteome analysis of purified P. falciparum FVs reveals several transporters

FV转运蛋白对疟疾寄生虫生物学至关重要，并且是恶性疟原虫耐药机制的关键参与者。本研究应用两种独立方法（磁性和化学分离）从成熟（34-38 hpi）滋养体中纯化恶性疟原虫FVs。通过显微镜评估制备物的纯度和均质性，如每个FV中HZ晶体的存在所示。由于产量和重复性更高，所有后续分析均使用磁性分离方法。通过免疫染色和Western blotting使用抗-Pffalcipain-2抗体进一步验证FVs的纯度，因为falcipain-2已被证明定位于FV。使用抗-PfMSP3、抗-PfClag9和抗-PfKAHRP抗体染色作为阴性对照。此外，使用 compartment-specific markers 排除其他细胞器的污染。对核标志物组蛋白H3、质膜蛋白Niemann-Pick Type C1（NCR1）和内质网（ER）伴侣蛋白结合免疫球蛋白蛋白（BiP）的免疫染色显示在FV制备物中无可检测信号，表明来自核、寄生虫质膜（PPM）或ER的污染极小。纯化的FVs随后裂解并进一步处理用于LC-MS/MS分析。纯化FVs的LC-MS/MS分析通过磁性和化学方案分别从三个生物学重复中鉴定出876和448种蛋白质。两种蛋白质组集之间共同检测到418种蛋白质。进一步分析在两种蛋白质组集中共同鉴定的蛋白质。重要的是，我们的蛋白质组分析鉴定出大多数已知的FV resident和FV膜蛋白，如falcipain-2、四种天冬氨酸蛋白酶（plasmepsins 1-IV）、PfCRT、PfMDR1、PfMDR2和PfV型H⁺-ATPase。由于两种FV转运蛋白PfCRT和PfMDR1与CQ耐药相关，我们接下来在FV蛋白质组数据中寻找各种转运蛋白。基于预测的转运蛋白/TM结构域和/或通道特性，在FV蛋白质组数据中鉴定出总共16种转运蛋白。我们还观察到PfKelch13蛋白在我们FV数据集中的存在。此外，PfCTR2被纳入我们的分析，因为它在一些早期运行中被鉴定。Alpha-soluble NSF attachment protein（PfSNAP）在大多数后续研究中作为 intra-FV control 被包括。

Immunostaining and immunoblot analysis of 3D7 and transgenic lines confirmed the presence of these new transporters in P. falciparum FVs

为确定FV富集部分中鉴定的某些转运蛋白的表达，我们生成了针对五种蛋白的肽特异性抗体，并生成了两种表达PfAQP-绿色荧光蛋白（GFP）和PfVDAC-GFP的转基因系。使用抗-PfCRT、抗-PfMDR1、抗-PfAQP、抗-PfVDAC和抗-PfSNAP抗体对恶性疟原虫滋养体以及纯化FVs的免疫定位研究揭示了这些蛋白在FVs中的表达与HZ晶体重叠。这些结果通过PfAQP-GFP和PfVDAC-GFP融合蛋白在FVs中的表达得到确认。纯化FV提取物的免疫印迹分析进一步验证了五种鉴定蛋白在恶性疟原虫FV中的表达。

Linking mutations in several FV transporter proteins with CQ or ART resistance via published genome sequences

随后通过PlasmoDB数据库中恶性疟原虫株系3D7、Dd2（CQ-、pyrimethamine-和mefloquine-resistant strain）、7G8（CQ-和pyrimethamine-resistant strain）、GB4（CQ-resistant strain）和KH02（ART-resistant strain）的已发布基因组序列对所有鉴定的恶性疟原虫FV转运蛋白进行了比较氨基酸序列分析。描述了这些株系中各种FV转运蛋白突变以及PfKelch13转运蛋白突变的全面细节。除了这些不同疟原虫株系中报告的PfCRT、PfMDR1和PfKelch13转运蛋白突变外，还观察到FV富集部分中鉴定的转运蛋白中的几种突变。PfKelch13蛋白在GB4和KH02寄生虫系中分别呈现K189T和C380Y突变；然而，在Dd2和7G8株系中没有呈现突变。鉴于对ART耐药系中转运蛋白突变的了解甚少，我们接下来通过PCR扩增和测序使用针对细胞外或 transmembrane（TM）结构域的不同引物组对两种耐药系IPC 5202（MRA1240）和INDO（MRA-819）（其基因组序列不可用）的九种FV富集部分中鉴定的转运蛋白PfMDR1、PfMDR2、PfNT1、PfNT4、PfMFR5、PfATP4、PfCTR2、PfAQP和PfUGT进行了突变分析。IPC5202和INDO株系分别对ART和CQ耐药。对每个PCR片段进行了三次独立序列分析，并在两条链上对片段进行了全长测序。在这些耐药系中鉴定出七种这些转运蛋白的突变。尽管这些转运蛋白在抗疟药物耐药中的作用需要通过遗传操作和功能测定进一步验证，但序列分析表明这些转运蛋白中的突变可能广泛贡献于抗疟耐药表型。

Prevalence of the identified mutations in the field isolates and their co-existence with PfKelch13 polymorphisms

接下来，通过重新分析从Pf3K、MalariaGEN获取的公开全基因组测序数据，分析了田间分离株中鉴定的FV转运蛋白突变的状况，该数据包括来自东南亚和非洲15个国家的2517个样本。通过snpEff版本4.3对数据进行 variant annotations，随后创建了一个二进制矩阵，其中0表示突变缺失，1表示突变存在。从这个矩阵中，过滤出我们感兴趣的突变并检查它们的共存模式。根据热图，流行的CRT突变，如K76T、A220S、Q271E、N326S、I356T和R371I，与MDR突变Y184F、S208N、G299D、F423Y和T484I强烈共存。为探索ART耐药寄生虫中FV转运蛋白突变的存在，我们研究了它们与上述田间分离株中PfKelch13突变（ART耐药的决定性标志物）的共存。尽管PfKelch13突变在这些田间分离株中并不广泛流行，但我们发现四种转运蛋白基因（PfCRT、PfNT1、PfCTR2和PfMDR2）具有与PfKelch13突变富集的突变。在这四种基因中，总共报告了18种多态性（单核苷酸多态性[SNPs]），其中六种SNPs specifically enriched in the ART-resistant parasites。为 statistically examine the co-occurring mutations in transporter genes and PfKelch13，进行了χ独立性检验。使用2×2网格格式比较K13的野生型（WT）/突变实例与候选基因的WT/突变实例的组合。有趣的是，所有六种转运蛋白基因突变均与K13多态性显著相关，P < 0.0001。PfKelch13和转运蛋白基因突变的全球分布谱进一步揭示了ART耐药田间分离株中转运蛋白突变的富集。总之，我们的分析揭示了恶性疟原虫田间分离株中PfKelch13突变与转运蛋白突变的共存和共关联，并揭示了转运蛋白突变在CQ和ART耐药寄生虫中的参与。

Site-directed mutagenesis and yeast complementation assays reveal a role for PfNT1 and/or PfMFR5 in conferring resistance to P. falciparum against DHA

为阐明FV localized transporters在抗疟耐药中的作用，我们使用表达WT或突变版本PfNT1和PfMFR5的酿酒酵母BY4741进行了酵母互补测定。通过使用肽特异性抗体对分离的恶性疟原虫FVs和滋养体进行免疫荧光染色 confirmed the subcellular localization of these transporters to the FV。密码子优化的编码WT PfNT1或PfMFR5蛋白的基因被克隆并插入pGPD2中用于在酿酒酵母BY4741中的功能表达。进行了定点诱变以将靶向突变引入PfNT1和PfMFR5基因中，以研究PfNT1和PfMFR5蛋白中突变的作用。对于PfNT1，引入了一个单一突变F394L，将苯丙氨酸替换为亮氨酸。对于PfMFR5蛋白，引入了两个突变：S278T（丝氨酸替换为苏氨酸）和Y570F（酪氨酸替换为苯丙氨酸），如材料与方法部分所述。酿酒酵母BY4741随后用WT或突变PfNT1或PfMFR5基因转化。转化酵母经受表型测定以评估它们的生长和抗疟药物敏感性谱。在8 mM和100 μM浓度的抗疟药物CQ和双氢青蒿素（DHA）存在下进行了点样和生长测定。如所示，表达WT PfNT1或PfMFR5蛋白的酵母细胞比用CQ处理的那些对DHA处理更敏感。WT酵母株对CQ或DHA没有显示显著敏感性。有趣的是，PfNT1蛋白中的F394L突变逆转了酵母对DHA以及CQ的敏感性。类似地，表达具有S278T或Y570F突变的PfMFR5蛋白的酵母呈现 noticeable reversal in DHA susceptibility，表明该蛋白参与DHA的转运，并且这些突变可能 contribute to DHA resistance。该表型通过生长动力学得到证实，其中WT转运蛋白株在DHA存在下显示 pronounced growth inhibition，而突变株随时间具有显著改善的生长。总之，这些发现连同不同地理分离株中ART耐药寄生虫中流行的突变表明，PfNT1和PfMFR5可能作为参与DHA摄取或 efflux 的转运蛋白起作用，并且这些蛋白内的特定突变可以改变它们对DHA的敏感性。

In silico structural analysis provides a robust platform for understanding the effects of mutations on ART resistance

为进一步理解点突变对两种这些转运蛋白PfNT1和PfMFR5耐药的影响，通过i-TASSER web服务器进行了 in silico 同源建模。从I-TASSER（Threading）生成了总共五个模型 each（PfNT1和PfMFR5）。我们仅选择具有最低C-score的最佳模型进行进一步分析。模型PfNT1（-0.96）和PfMFR5（-1.76）的C-score在可接受限度内。通过Ramachandran图评估它们的立体质量显示，PfNT1和PfMFR5分别有92%和85%残基在允许区域内。模型预测了PfNT1的单体形式，由11个TM alpha螺旋组成，跨越两个片段/区域（TM1-TM6和TM7-TM11），共同形成 central ligand binding cavity。类似地，PfMFR5模型预测了13个TM alpha螺旋跨越脂质双层。结构分析显示，PfNT1中的突变（F394L）位于TM11，而PfMFR5中的突变（Y570F）位于TM13。DHA与建模的WT和突变结构PfNT1和PfMFR5的分子对接进一步揭示，DHA环部分导致突变PfNT1蛋白与WT PfNT1蛋白相比发生构象变化。然而，在DHA存在下，在突变PfMFR5中没有观察到 such conformational changes。此外，我们计算了WT和突变PfTN1和PfMFR5 central cavity的静电势表面。与突变PfNT1相比，WT PfNT1在 central cavity exhibited the greatest electronegativity，这与对DHA分子的最高亲和力一致。类似地，DHA分子与WT和突变PfMRF5的对接研究显示，突变蛋白显示由于结合位点内的 rotamer shift 导致DHA分子结合减少，从而削弱了与DHA分子的相互作用。总之，建模数据表明，WT PfNT1和PfMRF5蛋白通过与DHA相互作用帮助在FVs内保留DHA。这些突变削弱了这些转运蛋白与DHA之间的相互作用， thereby reducing the retention of DHA in FVs and increasing the efflux of DHA。

DISCUSSION

理解耐药分子机制对于在田间部署组合疗法以对抗疟疾寄生虫至关重要。恶性疟原虫FV是许多抗疟药物的靶点，主要耐药机制包括 either point mutations in FV membrane proteins that mediate drug transport or point mutations in proteins that bind these drugs。在CQ耐药寄生虫的情况下，机制研究提供了证据表明两种转运蛋白PfCRT（C72S、M74I、N75E、K76T、A220S、Q271E、N326S、N326D、I356T和R371I）和PfMDR1（N86Y、Y184F、N661del、S1034C、N1042D和D1246Y）中的单核苷酸变异（SNVs） primarily responsible for decreased accumulation of CQ in the FV because of energy-dependent drug efflux mechanisms。恶性疟原虫中的ART耐药主要与PfKelch13中的SNVs（F446I、N458Y、M476I、Y493H、R539T、I543T、P553L、R561H、P574L或C580Y）相关，这些突变 appear to regulate the rate of endocytosis of Hb within FVs and exert other physiological effects that reduce ART toxicity。Bhattacharjee等人的最近研究显示了GFP标记和天然PfKelch13在寄生虫FV附近的膜 compartments 和寄生虫外围附近的 cytosomal structures 上的存在，进一步支持了PfKelch13与FV的关联。最近使用基因编辑、等基因pfcrt修饰突变寄生虫系的研究证明了地理区域特异性寄生虫对多种抗疟药物的敏感性，其作用方式与Hb导入和血红素解毒相交。转运蛋白介导的代谢物、脂质和离子稳态对于疟原虫FV的功能性至关重要。迄今为止，只有少数转运蛋白已知定位于/活跃于FV膜。在本研究中，我们进行了纯化恶性疟原虫FVs的详细蛋白质组分析，以理解FV转运蛋白的 spectrum 并详细分析它们在CQ、ART和其他多药耐药系中的序列。通过两种独立分离程序纯化的恶性疟原虫FVs的蛋白质组分析鉴定了418种共同蛋白质，这大约是先前报告的116种FV蛋白质的四倍。这可能归因于两项研究中使用的质谱仪类型。本研究使用了先进的质谱仪（Thermo Scientific Orbitrap Fusion Lumos Tribrid）。该仪器的架构包括四极杆、Orbitrap和离子阱质量分析器，允许高采集速率和离子分辨率。Lamarque等人的研究是在Bruker Daltonics Esquire 3000 Plus Mass Spectrometer上进行的，该型号现已过时。我们可以在我们的蛋白质组分析中鉴定出116种先前报告蛋白质中的86种。仔细分析转运蛋白在FV蛋白质组中鉴定出16种这些蛋白质。转运蛋白介导的离子、代谢物和脂质稳态对于疟原虫FV的功能性至关重要。然而，迄今为止，只有少数转运蛋白被鉴定在FV膜上，包括质子泵、代谢物转运蛋白超家族成员、铵 bicarbonate（ABC）转运蛋白和 formate-nitrite transporter。在本研究中，我们进一步鉴定了几种具有 proven localization on FV membrane 的转运蛋白。从疟原虫分离FVs在技术上具有挑战性，因为它们与其他细胞器的紧密关联和寄生虫的小尺寸。尽管采用 detergent lysis、机械 disruption 和 differential centrifugation，但与PPM、ER和核的完全分离是困难的。为评估潜在污染，我们进行了 compartment-specific markers 的免疫染色，确认了核（组蛋白H3）、PPM（NCR1）和ER（BiP）蛋白的缺失。然而，由于FV纯化的固有局限性，来自其他细胞 compartments 的 trace impurities 可能仍然存在。为探索这些鉴定的FV转运蛋白与抗疟耐药之间的潜在关联，分析了四种已建立耐药寄生虫系Dd2（多药耐药）、7G8（多药耐药）、GB4（CQ耐药）和KH02（ART耐药）的已发布基因组数据，并与3D7系的基因组数据进行了比较。比较基因组数据揭示了许多这些FV转运蛋白中的突变。类似方法先前应用于pfcrt和pfmdr1基因以鉴定各种田间分离株中的敏感或耐药恶性疟原虫系。通过PCR扩增和测序 extracellular and TM domains 在INDO（CQ耐药）和IPC 5202（ART耐药）株系中 confirmed few mutations in transport proteins identified in the FV-enriched fraction（PfMDR1、PfMDR2、PfNT1、PfNT4、PfMFR5、PfATP4、PfCTR2、PfAQP和PfUGT），并与可用基因组数据集进行了比较。我们进一步分析了来自WGS数据（Pf3k和MalariaGEN项目）的2517个田间分离株中这些转运蛋白的突变。CRT突变K76T、A220S、Q271E、N326S、I356T和R371I；MDR突变Y184F、S208N、G299D、F423Y和T484I在东南亚和非洲样本中高度流行。发现这些突变具有高水平的共存，表明FV蛋白突变的选择性进化和积累是疟疾寄生虫 adopted by malaria parasites 发展抗疟耐药性的通用方式。即使在ART耐药寄生虫（具有PfKelch13中的Y493H、R539T、I543T或C580Y突变）的情况下，也观察到与其他FV蛋白突变存在的强相关性。CRT突变N326S和I356T、NT1突变F394L、CTR2突变E49G以及MDR2突变G299D和T484I被观察到 specifically enriched in ART-resistant parasites and absent in ART-sensitive parasites。 additional determinants can contribute to multidrug resistance 的假设与早期发现ART耐药与fd（ferredoxin）、arps10（apicoplast ribosomal protein S10）、pfmdr2和pfcrt中非同义突变关联一致，这可能提供增强突变K13作为主要决定因素作用的遗传背景。此外，最近一项研究揭示，Pfmdr1和Pfcrt中的多态性导致药物在FVs和 cytosol 之间的重新分布；这种变化是这些寄生虫中抗疟耐药、多药耐药表型变异和 collateral drug sensitivities 的关键驱动因素。为 further illustrate the effect of newly identified mutation(s) on antimalarial resistance，在酵母细胞（酿酒酵母）中通过用WT或突变PfNT1和PfMFR5蛋白转化酿酒酵母进行了互补研究。用WT或突变PfNT1-F394L蛋白和WT PfMFR5或其突变体S278T和Y570F蛋白表达的酵母用各种浓度的CQ和DHA处理。生长曲线显示，在DHA存在下，表达突变PfNT1-F394L蛋白的酵母比表达WT PfNT1的酵母具有更大的生长模式。此外，与DHA的对接研究进一步 strengthened our findings，表明PfNT1和PfMFR5蛋白中的突变可能参与对DHA的耐药。本研究中呈现的结果表明，许多FV转运蛋白在药物 within FVs 的转运或保留中起重要作用，并且其中一些转运蛋白中的突变改变了药物在FV内的保留 dynamics。尽管本研究仅对两种转运蛋白PfNT1和PfMFR5进行了酵母互补测定，但其他转运蛋白的作用需要通过酵母互补测定或恶性疟原虫系中的基因编辑研究进行验证。这里呈现的数据 nevertheless support more multicentric genome-wide associations among the various transporters along with gene-editing studies to further test the co-contributions of various transporters to antimalarial drug resistance。