开发一种针对呼吸道合胞病毒的电子病毒颗粒（eVLP）mRNA疫苗，该疫苗能够增强融合前阶段的免疫反应，从而激发更强的体液免疫应答

《Journal of Virology》：Developing an eVLP mRNA vaccine for respiratory syncytial virus with enhanced pre-fusion targeting humoral responses

　　降低呼吸道合胞病毒感染风险的预融合蛋白EABR mRNA疫苗通过增强中和抗体和Th1免疫应答实现高效保护。

　　呼吸合胞病毒（RSV）是导致婴幼儿、老年人以及免疫功能低下人群下呼吸道疾病（LRTD）的主要原因之一。这项研究利用创新的EABR（ESCRT和ALIX结合区域）疫苗技术，开发了一种基于RSV前融合（Pre-F）蛋白的mRNA疫苗（Pre-F-EABR），该疫苗编码能够自组装的包膜病毒样颗粒（eVLPs）。在体外表达中，Pre-F-EABR mRNA表现出显著的Pre-F蛋白表达，特别是在细胞膜和细胞培养上清液中，这表明其高效的eVLP自组装能力。通过脂质纳米颗粒（LNPs）封装的核苷酸修饰mRNA（mRNA-LNPs）免疫小鼠，结果显示Pre-F-EABR疫苗在中和活性和细胞免疫反应方面均优于传统Pre-F或Pre-F-Fe（Pre-F-铁蛋白纳米颗粒）mRNA疫苗。值得注意的是，Pre-F-EABR疫苗诱导了显著更高的保护性前融合特异性抗体水平，相较于后融合靶向抗体，这大幅降低了RSV挑战后小鼠肺部的病毒载量。此外，Pre-F-EABR疫苗在针对当前临床RSV-A（ON1基因型）和RSV-B（BA9基因型）毒株的保护效果方面表现出显著提升。总体而言，这些发现表明Pre-F-EABR mRNA疫苗能够诱导更强的免疫反应，凸显了其在预防RSV感染中的潜力。

RSV感染在婴幼儿、老年人和免疫缺陷人群中具有重要的公共卫生意义。目前，增强中和抗体水平和Th1偏倚的细胞免疫反应被认为是提高RSV疫苗效果和安全性的关键策略。尽管基于RSV后融合蛋白（Post-F）的疫苗在临床试验中仅显示出有限的保护效果，但基于前融合蛋白（Pre-F）的疫苗在临床评估中显示出更强的免疫原性和更优的保护效果，主要归因于其能够诱导高亲和力的中和抗体和记忆B细胞反应。然而，Pre-F蛋白的构象不稳定性曾是其临床转化的主要障碍。结构导向的稳定策略，特别是通过合理设计二硫键和腔填充突变，成功克服了这一限制，从而推动了RSV疫苗的革新。目前，已有三种获批的RSV疫苗，包括GSK的Arexvy、Moderna的mResvia和Pfizer的Abrysvo，以及多种处于临床前和临床研究阶段的候选疫苗。

新冠疫情中，Moderna和Pfizer开发的mRNA疫苗在安全性、有效性和可靠性方面取得了显著进展。这些疫苗通过利用宿主细胞的蛋白质合成机制，能够高效地激活特异性体液免疫反应和T细胞免疫。这一特性对于RSV疫苗开发尤为重要，因为mRNA平台能够优先诱导强烈的体液反应和Th1偏倚的细胞免疫。例如，Moderna的mResvia疫苗在60岁以上人群中对RSV相关LRTD的保护效果达到83.7%，但在18个月后其效果下降至约50%，这凸显了当前RSV mRNA疫苗设计在提供长期保护方面仍需进一步优化。

近年来，一种创新的mRNA疫苗策略引入了EABR技术，通过将EABR段整合到严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）刺突蛋白的胞质尾部，利用宿主细胞的ESCRT（内体分选复合物所需运输）和ALIX（ALG-2互作蛋白X）结合机制，促进了包膜病毒样颗粒（eVLPs）的自组装。与传统的新冠mRNA疫苗相比，Spike-EABR疫苗在预临床模型中诱导了更强的中和活性和更有效的T细胞免疫反应。然而，这一平台在其他高优先级病原体如RSV中的广泛应用尚未得到充分探索。

在此研究中，我们采用eVLP疫苗技术开发了一种新型的RSV Pre-F-EABR mRNA疫苗。在小鼠模型中的比较免疫研究显示，脂质纳米颗粒封装的、核苷酸修饰的Pre-F-EABR mRNA诱导了更强的中和活性和更显著的T细胞反应，相较于基于Pre-F蛋白和Pre-F-Fe纳米颗粒的疫苗。特别是，Pre-F-EABR疫苗诱导了显著更高的保护性Pre-F特异性抗体水平，相较于后融合靶向抗体，这有效降低了RSV挑战后小鼠肺部的病毒载量。此外，Pre-F-EABR疫苗在对抗当前临床RSV-A（ON1基因型）和RSV-B（BA9基因型）毒株方面展现出更广泛的保护效果。这些结果表明，Pre-F-EABR mRNA疫苗能够诱导强烈的免疫反应，显示出在预防RSV感染方面的巨大潜力。

在体外研究中，我们评估了Pre-F-EABR mRNA疫苗的表达特性。通过TBE RNA凝胶电泳和毛细管电泳分析，所有RSV mRNA构建体均显示出单一、均质的峰，对应预期的大小，且完整性值均超过90%。将这些mRNA转染至BHK-21细胞后，我们通过间接免疫荧光染色和荧光扫描分析了抗原的表达情况。结果显示，Pre-F-EABR mRNA在细胞膜上的定位显著增强，相较于其他构建体，其抗原富集程度提高了8倍以上。这表明Pre-F-EABR设计能够有效促进eVLP的组装和释放，从而增强免疫细胞的激活。此外，通过Western blot分析，我们证实了Pre-F-EABR mRNA在HEK293T和HEK293F细胞上清液中能够产生可检测的eVLPs，而Pre-F和Pre-F-Fe构建体则未能检测到eVLPs的释放。

在小鼠模型中，我们进一步评估了Pre-F-EABR疫苗的免疫原性和保护效果。通过不同的剂量（0.1、1和5 μg）进行初次和加强免疫后，我们发现Pre-F-EABR疫苗能够诱导显著增强的Pre-F特异性IgG抗体反应。特别是，5 μg剂量的疫苗在所有测试的RSV亚型中均表现出最高的抗体滴度和最强的中和能力。加强免疫后，Pre-F-EABR疫苗的中和抗体滴度进一步提升，其对RSV A2、ON1和BA9毒株的中和活性分别提高了3.8倍、3.7倍和3.5倍，相较于其他疫苗构建体。此外，Pre-F-EABR疫苗在1 μg剂量下也表现出更显著的中和活性，其对RSV A2、ON1和BA9毒株的中和滴度分别比Pre-F和Pre-F-ctm疫苗提高了5.8倍、4.9倍和3.4倍。这些结果表明，Pre-F-EABR疫苗在诱导中和抗体反应方面具有显著优势。

在T细胞反应方面，我们通过细胞内细胞因子染色（ICS）和酶联免疫斑点（ELISpot）分析了Pre-F-EABR疫苗的效果。结果表明，Pre-F-EABR疫苗能够诱导更强的CD4+和CD8+ T细胞反应，相较于其他疫苗构建体。特别是在IFN-γ、TNF-α和IL-2等Th1相关细胞因子的分泌方面，Pre-F-EABR疫苗表现出更高的水平。这表明该疫苗能够优先诱导Th1偏倚的细胞免疫反应，有助于增强整体免疫保护效果。此外，ELISpot分析进一步支持了这一结论，显示Pre-F-EABR疫苗能够显著提高Th1型T细胞反应的频率。

在RSV挑战实验中，我们评估了Pre-F-EABR疫苗的保护效果。结果显示，接种Pre-F-EABR疫苗的小鼠在肺部和鼻部的病毒载量显著降低，甚至达到检测限。相比之下，接种其他疫苗构建体的小鼠在肺部和鼻部的病毒载量显著升高，表明Pre-F-EABR疫苗在预防RSV感染方面具有更优的效果。这些结果与疫苗诱导的中和抗体反应和T细胞免疫反应相一致，进一步验证了其作为RSV疫苗候选物的潜力。

此外，我们还探讨了Pre-F-EABR疫苗在不同动物模型中的应用。虽然BALB/c小鼠模型是RSV疫苗研究中常用的模型，但其对人类RSV的复制能力有限。因此，我们计划进一步在棉鼠（Sigmodon hispidus）等更合适的模型中评估该疫苗的效果，以更好地模拟人类RSV感染和免疫反应。同时，我们还注意到，尽管Pre-F-EABR疫苗在小鼠模型中表现出优异的免疫原性和保护效果，但在人类临床试验中，其剂量可能需要调整以确保安全性和有效性。例如，小鼠的免疫剂量通常为0.1-10 μg，而人类临床试验中使用的剂量为30-100 μg，因此未来的研究需要在更接近人体的模型中评估该疫苗的剂量效果。

综上所述，这项研究开发了一种新型的RSV mRNA疫苗，即Pre-F-EABR疫苗。通过整合EABR技术，该疫苗能够高效地生成eVLPs，并在小鼠模型中诱导显著增强的体液免疫反应和更强烈的T细胞免疫反应。这些发现不仅为RSV疫苗的开发提供了新的思路，也为进一步的临床研究奠定了基础。Pre-F-EABR疫苗的潜力在于其能够同时增强中和抗体反应和Th1偏倚的细胞免疫，这可能使其在预防RSV感染方面具有更广泛的应用前景。未来的研究将重点评估该疫苗在不同剂量下的免疫原性、保护效果和安全性，并探索其在更复杂的免疫模型中的表现。这些研究将有助于进一步优化RSV疫苗设计，以满足不同人群的需求，特别是婴幼儿和老年人等易感群体。