靶向粘附GPCR CD97的抗体药物偶联物开发：为AML和GBM提供新型治疗策略

　　本研究成功开发了靶向粘附G蛋白偶联受体（aGPCR）CD97的抗体药物偶联物（ADC），通过独特的抗原识别机制（涉及抗体框架区与GAIN结构域相互作用）实现高效内化，显著抑制急性髓系白血病（AML）和胶质母细胞瘤（GBM）细胞活性，为靶向aGPCR家族提供了重要范式。

　　

Engineering antibody–drug conjugates targeting an adhesion GPCR, CD97

Significance

近年来遗传学与蛋白质组学进展揭示了粘附G蛋白偶联受体（aGPCR）与人类疾病的关联。尽管aGPCR具有适合抗体疗法的分子结构，其治疗潜力仍远未充分开发。本研究通过开发靶向CD97中GPCR自裂解诱导（GAIN）结构域的有效抗体药物偶联物（ADC），证实了aGPCR可作为治疗靶点。尤其重要的是，GAIN结构域在所有aGPCR中高度保守，这为靶向该受体家族提供了通用策略。结构学研究还发现了一种罕见的抗体-抗原相互作用模式，其中抗体框架区域广泛参与结合，拓宽了对抗原识别分子机制的认识。

Abstract

粘附G蛋白偶联受体（aGPCR）是参与多种细胞功能的关键细胞粘附分子，与癌症等人类疾病密切相关。aGPCR拥有巨大的胞外区域（ECR），可作为易接近的抗原靶点，但其作为生物治疗靶点的潜力尚未被系统探索。CD97（又称ADGRE5）是一种在急性髓系白血病（AML）、胶质母细胞瘤（GBM）及其肿瘤干细胞中高表达的aGPCR。本研究开发了靶向CD97的抗体药物偶联物（ADC），并评估了其对AML和GBM细胞的疗效。通过合成人源抗体库筛选，我们获得了靶向CD97不同表位的一组抗体，其中A8抗体表现出高效内化特性。该抗体可识别所有人源CD97亚型，但不结合其近源同源物EMR2。单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）结构解析显示，A8通过非常规结合模式靶向CD97的GAIN结构域——其轻链框架区域广泛参与抗原识别。通过偶联方法和载荷物筛选，我们最终获得了稳定性优异的ADC，能有效杀伤AML和GBM细胞系以及患者来源的GBM干细胞，同时对健康供体外周血单核细胞（PBMC）仅产生最小细胞毒性。本研究证明了靶向CD97及aGPCR GAIN结构域的治疗潜力，并揭示了一种前所未有的抗体抗原识别表面。

研究背景

粘附G蛋白偶联受体（aGPCR）是GPCR超家族中第二大类受体，其结构包含N端胞外区（ECR）、七次跨膜区（7TM）和胞内区。其特征是拥有包含多种蛋白质相互作用结构域的大片段ECR，以及靠近7TM区域的GPCR自裂解诱导（GAIN）结构域。GAIN结构域在aGPCR中高度保守，能在GPCR蛋白酶切位点（GPS）催化自裂解，产生保持非共价结合的N端和C端片段。配体诱导N端片段解离后，暴露Stachel肽段（紧邻GPS C端并靠近7TM区域），该肽段折叠至7TM区域调控G蛋白偶联信号传导。aGPCR在生理过程（如发育和免疫）中发挥关键作用，并与神经发育障碍、免疫疾病和癌症等人类疾病相关。

与传统GPCR（胞外表面缺乏结构化区域，主要采用小分子药物靶向）不同，aGPCR的大片段胞外区域为抗体疗法提供了有吸引力的抗原靶点。然而目前尚无FDA批准的靶向aGPCR的生物药物。CD97由ADGRE5基因编码，属于表皮生长因子七次跨膜（EGF-TM7）aGPCR亚家族。其在炎症反应期间的免疫细胞以及多种恶性肿瘤细胞中表达上调。CD97是AML细胞中表达水平最高的抗原之一，而在造血干细胞（HSC）中表达较低。它还在AML中调控原始细胞生长、存活和分化过程中起关键作用。在GBM中，CD97在肿瘤细胞上的表达水平远高于正常脑组织和神经祖细胞（推测的肿瘤起源细胞）。CD97在白血病干细胞（LSC）和胶质母细胞瘤干细胞（GSC）中同样过表达，这些干细胞导致治疗抵抗和治疗后复发，因此清除它们对改善AML和GBM治疗效果至关重要。

CD97通过选择性剪接产生三种不同亚型，其EGF样结构域数量各异，这些结构域部分负责配体结合。GAIN结构域在所有亚型中保守。其近源同源物EMR2与CD97结构基本一致，在EGF样结构域序列高度同源，但GAIN结构域序列一致性较低。值得注意的是，尽管序列和结构高度相似，CD97在AML和GBM细胞中的上调表达频率高于EMR2，而EMR2主要在其他造血细胞类型中表达。因此选择性靶向CD97而非EMR2有助于降低潜在毒性风险。

由于CD97在活化免疫细胞表面表达上调，依赖免疫细胞介导细胞毒性机制（如抗体依赖性细胞毒性ADCC、抗体依赖性细胞吞噬作用ADCP、T细胞介导反应等）的治疗策略可能无法有效靶向癌细胞表面的CD97。因此我们探索了抗体药物偶联物（ADC）的应用价值，这类新兴治疗方式不依赖免疫系统参与即可发挥作用。ADC通过抗体靶向细胞表面抗原，促进ADC-抗原复合物内化进入抗原表达细胞，从而选择性递送细胞毒性载荷物，较传统化疗显著提高治疗指数。开发具有高特异性和高内化效率的抗体对于研制高效ADC至关重要。

Results

Generation and Characterization of Human Synthetic Antibodies Targeting CD97

为获得选择性识别人源CD97的抗体，我们使用噬菌体展示技术对人源合成抗体库（Fab形式，约10¹⁰个独立克隆）进行分选，靶标为CD97亚型1和2（最长和最短亚型）的纯化ECR。通过负筛选（使用EMR2亚型ECR）和提高筛选严格性，我们获得了候选抗体A8、C27和D25。珠基结合实验显示所有抗体对CD97的表观解离常数（K_D）值均在纳摩尔范围，且不结合EMR2，表明具有高亲和力和选择性。表位分组显示这些抗体结合不同表位。为进一步扩大抗体多样性，我们使用OCI-AML3细胞（高表达CD97）进行第二轮噬菌体库分选，并在饱和浓度A8、C27和D25 Fab竞争下避免获得相同表位抗体。最终我们获得了针对CD97 ECR上六个非重叠表位的高亲和力抗体。

通过截短突变体结合实验，我们进一步明确了这些抗体的表位：2V10和C27分别识别EGF-1和EGF-3结构域，其余抗体均靶向GAIN结构域。这解释了抗体对CD97亚型和EMR2的选择性差异。为评估ADC常用格式抗体的亲和力和内化效率，我们将六种抗体制备为人源IgG1格式（引入L234A/L235A/P329G（LALAPG）突变消除Fc受体结合）。细胞结合实验显示所有抗体对内源性CD97的半数有效浓度（EC₅₀）值均为纳摩尔级。通过pH敏感染料pHAb评估内化效率发现，不同抗体（甚至同靶GAIN结构域）的内化效率存在差异，其中A8表现最佳。其内化效率与CD97表达水平正相关，证实内化由抗原结合介导。

Cryo-EM Structure of A8 in Complex with CD97

为阐明A8识别CD97的分子机制，我们通过单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）解析了A8 Fab与CD97亚型1 ECR复合物的结构（名义分辨率3.1?）。我们在GAIN结构域引入S531A突变防止自裂解。结构显示清晰