通过双特异性抗体介导的预定位实现HIV-1的广泛中和

　　本研究发现，通过双特异性抗体（bsAb）将靶向gp41 NHR区域的抗体预定位至HIV-1入侵位点（CCR5），可突破传统NHR抗体中和能力有限的瓶颈，实现对119种多亚型HIV-1假病毒的100%中和（IC80 < 5 μg/mL），为HIV-1预防和治疗提供了新策略。

　　

Significance

HIV-1感染防治的关键靶点之一是病毒融合蛋白gp41上保守的N-七肽重复区（NHR），但针对该位点的抗体以往表现出有限的中和效力。本研究设计了一种双特异性抗体（bsAb），通过结合HIV-1共受体CCR5，将靶向NHR的抗体预定位至病毒入侵位点，从而显著提高了中和能力。该策略在对大量HIV-1毒株的面板测试中实现了完全的中和广度（IC₈₀ < 5 μg/mL）。由于几乎所有初始HIV-1感染均通过CCR5嗜性病毒发生，该策略预计可作为一种有效的预防手段，并进一步支持靶向NHR作为可行治疗方法的理念。

Abstract

识别I类病毒膜融合蛋白保守预发夹中间体（PHI）的抗体通常表现出有限的中和作用，因此一直未被视作有前景的治疗剂。我们先前开发了一种双特异性抗体iMab/D5_AR，其同时靶向HIV-1 PHI中暴露的gp41 N-七肽重复区（NHR）和T细胞上的HIV-1受体CD4。CD4的结合使bsAb在病毒融合位点预定位，增强了其中和效力，并在119种多亚型假病毒HIV-1病毒面板中实现了95%的广度（IC₈₀ < 5 μg/mL）。在本研究中，我们进一步设计了一种靶向NHR且同时靶向CCR5（T细胞上两种HIV-1共受体之一）的bsAb。这一优化的bsAb设计进一步提高了中和效力，并对119种假病毒实现了100%的中和广度，包括那些对CD4结合的iMab/D5_AR耐药的病毒。考虑到几乎所有初始HIV-1感染均通过CCR5嗜性病毒发生，我们预期这种针对CCR5重新设计的bsAb将成为有效的预防剂。这些发现进一步支持了将NHR作为HIV-1治疗靶点的合理性，并为新一代工程化广泛中和抗体（bnAb）奠定了基础。

Results

Engineering and Evaluation of a bsAb for Prepositioning on Host Cells

为生成可预定位靶向NHR抗体的bsAb，研究人员构建了D5_AR与P140（也称为PRO140或leronlimab）的杂交体，其中P140可与gp120竞争结合CCR5。研究中采用了先前用于生成iMab/D5_AR的相同bsAb构建策略，整合了CrossMab设计（其中一个IgG抗体臂在Fab区包含重链和轻链交叉）以及促进高纯度异二聚体bsAb生成的“杵臼”突变。此外，还在设计中加入了H435R和Y436F突变以消除蛋白A结合。最终获得的异二聚体bsAb D5_AR/P140在抗CCR5重链（臼臂）中包含H435R和Y436F突变，在抗NHR重链（杵臂）中包含杵突变。作为对照，研究人员将靶向无关埃博拉糖蛋白的抗体mAb114的Fab臂插入杵臂或臼臂，分别生成构建体c/P140和D5_AR/c。通过流式细胞术评估D5_AR/P140及对照抗体同时结合CCR5和NHR模拟物的能力，结果显示仅D5_AR/P140能同时与细胞及NHR模拟物结合，表明该bsAb可按设计同时结合CCR5和NHR，是实现病毒感染的预定位的有效工具。

Bispecific Antibody-Mediated Prepositioning on CCR5 Enhances HIV-1 Neutralization by D5_AR

为评估D5_AR/P140的中和效力，研究人员采用基于荧光素酶的报道实验，并使用包含26种HIV-1假病毒的面板进行测试。该面板包含来自不同亚群和中和层次的毒株，以确保评估的代表性。两个对照抗体D5_AR/c和c/P140（各自仅包含一个功能性Fab臂，分别靶向NHR或CCR5）及其组合对所有测试的假病毒均表现出有限至中度的中和活性。相比之下，D5_AR/P140对面板中所有26种假病毒均表现出强效中和。该病毒面板包括R5（CCR5）、X4（CXCR4）及双嗜性R5X4嗜性的假病毒。单特异性靶向CCR5的抗体P140仅对R5嗜性假病毒表现出中度中和，而X4嗜性的HXB2和R5X4嗜性的WEAUd15.410.5017假病毒对P140耐药。然而，由于TZM-bl细胞表达CCR5，D5_AR/P140 bsAb能强效中和这两种假病毒，IC₈₀值分别为0.075 μg/mL和0.15 μg/mL，表明通过P140预定位D5_AR是最大化其活性的关键。

D5_AR/P140 Exhibits Potent and Exceptionally Broad Neutralization

为进一步测试D5_AR/P140的中和效力和广度，研究人员将病毒面板扩展至包含119种多亚型HIV-1假病毒。该面板代表了广泛的遗传多样性，几乎全部由层级2/3病毒组成，并包含传播/创始人病毒的代表，已被用作评估新型bnAb广度和效力的标准参考面板。研究人员将D5_AR/P140的活性与13种抗体进行了比较：包括通过结合CD4将D5_AR预定位至病毒融合位点的iMab/D5_AR、靶向gp41 MPER的10E8v4（其中和数据来自先前研究），以及另外11种bnAb（数据来自CATNAP数据库）。这些抗体靶向HIV-1 Env三聚体的不同区域，这些区域在其天然预融合形式中可及。与iMab/D5_AR（中位IC₈₀值为0.52 μg/mL）相比，D5_AR/P140的效力提高了6.4倍，中位IC₈₀值为0.082 μg/mL。为评估D5_AR/P140中和效力的临床相关性，研究人员比较了其针对119种病毒假病毒面板的IC₈₀值与抗体介导的预防（AMP）试验中建立的阈值。AMP试验评估了患者来源的CD4结合位点bnAb VRC01用于暴露前预防的效果，并证明体外中和效力与人类HIV-1预防效力相关。在这些试验中，对于IC₈₀值 >5 μg/mL、<1 μg/mL和 <0.2 μg/mL，临床预防效力估计分别为0%、75%和>80%。D5_AR/P140对100%的测试病毒实现了IC₈₀ < 5 μg/mL，对99%的病毒实现了IC₈₀ < 1 μg/mL，对92%的病毒实现了IC₈₀ < 0.2 μg/mL，表明其具有高临床预防潜力。

Prepositioning Strategy Affects the Neutralization Profile of D5_AR

研究人员评估了D5_AR/P140对五种对iMab/D5_AR耐药的假病毒和病毒的中和效力。在iMab/D5_AR的选择压力下，先前通过体外假病毒深度突变扫描（DMS）和体内病毒包膜测序（在具有CXCR4嗜性的复制 competent NL4-3中）鉴定出其中四种耐药突变（位于BF520（CCR5嗜性）包膜的H564、L568、K574和Q577残基）。所有五种突变均位于NHR的疏水口袋，即D5_AR抗体的结合位点。这些残基高度保守，对Los Alamos HIV数据库中超过8000个Env序列的分析证实了这一点。研究人员还测试了第六种病毒MVP-5180，一种具有R5X4嗜性的O组（外围）HIV-1分离株，其在保守D5表位（K574和Q577）存在偏差（R574和R577）。与两种对照抗体D5_AR/c和c/P140相比，D5_AR/P140增强了对所有六种病毒的中和。值得注意的是，与X4嗜性病毒HXB2类似，X4嗜性的rcNL4-3 Q575R突变体对P140耐药，但可被D5_AR/P140强效中和。这一比较突显了X4嗜性病毒对P140的一致性耐药，并表明D5_AR/P140 bsAb可中和病毒，无论其共受体使用情况如何。最后，与iMab/D5_AR的比较显示，iMab/D5_AR对所有突变病毒和外围病毒均表现出弱至中度的最大百分比抑制中和，而D5_AR/P140在整个面板中均表现出强效中和。

Discussion

gp41 NHR仅在PHI期间短暂暴露，限制了靶向NHR的抗体与完整病毒粒结合的能力。先前通过结合CD4的iMab（iMab/D5_AR bsAb）将靶向NHR的D5_AR预定位至PHI中的病毒融合位点的设计。优化的bsAb设计D5_AR/P140通过结合CCR5将抗体预定位至短暂暴露的NHR，表现出独特且改进的中和作用，实现了对大型假病毒面板的完全中和（100%广度，预测临床预防效力范围从>0%到>80%），并保持了对iMab/D5_AR耐药病毒的中和。与先前描述通过FcγRI增强中和作用的工作一起，这些结果表明通过CD4或CCR5预定位D5_AR可增强其中和效力并导致不同的中和谱。据我们所知，D5_AR/P140是迄今为止报道的最广泛中和的工程化HIV-1抗体。

尽管靶向MPER的10E8基bsAbs（10E8/iMab）表现出对具有10E8表位突变的假病毒的耐药性，但本研究的情况有所不同。尽管在高度保守的D5_AR表位存在突变，但中和谱因预定位是通过CD4还是CCR5而异。值得注意的是，10E8与靶向NHR的恩夫韦肽和D5_AR均具有协同作用，并且对靶向NHR的抗体耐药的病毒可能变得对恩夫韦肽敏感，这表明10E8、D5_AR和恩夫韦肽可有效用于联合治疗。

作为长效预防剂，Lenacapavir对HIV-1感染具有100%的保护作用，改变了HIV-1预防策略的格局。然而，对于治疗，在一些具有多药耐药HIV-1的患者中，联合治疗期间迅速出现耐药性，表明lenacapavir具有低遗传耐药屏障。本研究中的bsAb可能补充其疗效，特别是在减少母婴传播（MTCT）方面。虽然通过有效的公共卫生干预措施，MTCT已显著减少，但儿科HIV-1感染疫情持续存在，全球每年估计发生150,000例新发儿科感染。尽管胎盘作为HIV-1的部分屏障，并不能完全预防宫内传播，最高风险发生在分娩前最后14天。抗逆转录病毒（ARV）预防可减少MTCT，但仍面临挑战，包括母亲依从性和耐药病毒株。基于抗体的预防以防止HIV-1 MTCT正在探索中，本文所述的bsAb D5_AR/P140可能是在此背景下考虑的有吸引力的候选者。它可以给孕妇给药，利用Fc-新生儿Fc受体（FcRn）介导的胎盘转移效率，或直接给婴儿给药，因为抗体的被动免疫在新生儿中代表了一种耐受性良好且安全的方式。

与单特异性抗体相比，bsAb的较高制造成本仍然是一个重要的考虑因素，特别是在资源有限的环境中。尽管如此，靶向HIV-1的bsAb目前正处于临床开发中。这些包括靶向gp41 MPER和CD4的10E8/iMab（NCT05890963），以及同时靶向gp120 V2顶端和CD4结合位点的CAP256J3LS（NCT06585891）。本文所述的bsAb D5_AR/P140仍处于早期格式，预计下一代版本将整合诸如Fc工程以增加其与FcRn的结合以延长半衰期，或使用共同轻链等特征，以进一步改善药代动力学和可制造性。

我们承认该方法的潜在局限性。尽管D5_AR可以中和具有CXCR4嗜性的病毒，但利用P140的bsAb不会靶向CCR5阴性细胞，而CXCR4嗜性病毒仍然可以感染这些细胞。然而，maraviroc（一种FDA批准的变构CCR5抑制剂）突显了CCR5作为HIV-1治疗靶点的临床相关性，此外，几乎所有初始HIV-1感染均通过CCR5嗜性病毒发生。事实上，CCR5的纯合缺失（Δ32）已被报道可赋予对HIV-1获取的抵抗力。同样，本设计中使用的靶向CCR5的抗体P140（也称为leronlimab）在最近的2b/3期临床试验中证明了可降低血浆HIV-1水平。因此，通过CCR5预定位D5_AR，D5_AR/P140可能作为一种有效的预防剂。

总体而言，研究结果表明，用工程化bsAb D5_AR/P140靶向PHI可产生强效且异常广泛的中和作用。这些结果进一步支持NHR作为可行的治疗靶点，并定义了一类新的抗HIV-1工程化bnAb。

Methods

Bispecific Antibody Expression and Purification

抗体重链和轻链的基因由Integrated DNA Technologies合成。这些基因使用In-Fusion HD Cloning Kit（Clontech）插入线性化的双特异性IgG1质粒中，该质粒按先前描述制备。为生产bsAb，将编码带有杵的重链、轻链、带有臼的CrossMab重链和CrossMab轻链的质粒以1:1:1:1的比例使用FectoPRO转染试剂（Polyplus）共转染到Expi293F细胞（Thermo Fisher Scientific）中。细胞在37°C、8% CO₂、120 rpm振荡下培养。4至5天后，通过4,000×g离心10分钟收集细胞，上清液通过0.22 μm膜过滤。bsAb首先使用5 mL MabSelect Sure PRISM?柱（Cytiva）在?KTA Pure FPLC系统上进行初步纯化，随后通过Superdex 200 Increase 10/300 GL柱（GE Healthcare）进行尺寸排阻色谱进一步纯化。

HIV-1 Virus Production

HIV-1假型慢病毒通过将10 μg HIV-1 Env质粒和20 μg pSG3ΔEnv骨架质粒（目录号11051，NIH AIDS Reagent Program）使用BioT转染试剂（Bioland Scientific LLC）按照制造商方案共转染HEK293T细胞产生。转染后16小时，更换培养基为新鲜培养基。2天后收集病毒上清液，300×g离心5分钟，通过0.45 μm膜过滤，并储存于-80°C备用。

复制 competent HIV-1按先前描述产生和滴定。简言之，使用FuGENE（Promega）按照制造商指南将全长HIV-1质粒转染到HEK293T细胞中。培养基更换和病毒收集如上所述进行。

Cell Culture

TZM-bl细胞（源自NIH AIDS Reagent Program，最初由John C. Kappes和Xiaoyun Wu提供）和HEK293T细胞在补充有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素（Corning）和1% L-谷氨酰胺（Corning）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养。细胞在37°C、5% CO₂的加湿环境中孵育。

Viral Neutralization Assay

使用表达HIV-1 Tat调控荧光素酶报道基因的TZM-bl细胞来量化病毒感染和抗体中和，如先前所述。简言之，将5,000个TZM-bl细胞在白壁96孔板中过夜接种，并在37°C、5% CO₂的加湿环境中孵育。第二天，去除培养基，并将50 μL不同浓度的bsAb添加到细胞中孵育1小时。随后，加入50 μL含有HIV-1假型慢病毒和DEAE-葡聚糖（10 μg/mL）的混合物。48小时后，裂解细胞，并加入BriteLite Plus试剂（Perkin Elmer）测量荧光素酶活性。使用Synergy HTX多功能读数仪（BioTek）读取相对光单位（RLU）。使用公式计算感染百分比：[%感染 = (测试孔RLU – 背景RLU) / (仅病毒孔RLU – 背景RLU) × 100]。仅含细胞的孔作为背景对照。

Flow Cytometry

表达CCR5的TZM-bl细胞在流式细胞术缓冲液（1% [w/v] BSA in PBS with 0.05% [w/v] sodium azide）中与10 nM bsAb在4°C孵育1小时。用流式细胞术缓冲液洗涤四次后，细胞与10 nM生物素化的IQN17 NHR疏水口袋模拟物在4°C孵育1小时。经过额外洗涤后，细胞用链霉亲和素-APC（1:200, BioLegend）和异硫氰酸荧光素（FITC）标记的Fab片段山羊抗人IgG（1:50, Jackson ImmunoResearch）在4°C染色1小时。细胞洗涤四次后，在Accuri? C6 Plus流式细胞仪（BD Biosciences）上进行分析和分选。每个样本收集10,000个细胞的数据，使用FlowJo软件进行分析。