利用叶绿体基因组解析石斛杂交种“黑黄金”的母系起源与分子鉴定策略

　　本研究针对药用石斛市场因形态相似导致的杂交种“黑黄金”（Dendrobium 'Black Gold'）误用问题，通过De novo测序获得其与亲本D. nobile、D. officinale的完整叶绿体基因组（cp genomes），揭示其高度保守的四分体结构、基因组成及密码子使用偏好性。系统发育分析明确D. officinale为母本，并筛选出accD-psaI和matK-rps16等高变区作为特异性分子标记。研究为石斛杂交种鉴定提供可靠策略，支持其资源保护与合理利用。

　　

在传统中药材市场中，石斛属（Dendrobium）植物因其显著的药用价值备受关注，其中金钗石斛（D. nobile）和铁皮石斛（D. officinale）被《中国药典》收录为正式药材。然而，随着人工杂交品种的涌现，市场上出现了以“黑黄金”（Dendrobium 'Black Gold'）为代表的杂交石斛，其形态与铁皮石斛极为相似，均具有紫红色圆柱状茎，同时又与金钗石斛共享紫花的特征。这种高度的表型相似性导致市场上屡屡发生误用和冒充现象，不仅严重影响药材的真实性和疗效，还可能对消费者健康构成潜在威胁。此外，化学分析表明，“黑黄金”与其亲本在挥发性成分上存在显著差异，例如“黑黄金”以(-)-α-蒎烯和β-石竹烯为主，而铁皮石斛则主要含壬醛、α-蒎烯和柠檬烯等。这些差异进一步凸显了准确鉴定物种的紧迫性。传统的形态学和化学鉴定方法受主观性和环境因素影响较大，而现有分子标记（如rbcL、matK等）虽能区分部分石斛物种，但对“黑黄金”及其亲本的鉴别仍缺乏有效方案。因此，开发一种高效、准确的分子鉴定技术已成为当前石斛资源研究与利用的核心问题。

为解决这一难题，研究人员选择叶绿体基因组（chloroplast genome, cp genome）作为突破口。cp基因组因其结构保守、序列信息丰富及母系遗传特性，已成为植物系统发育和物种鉴定的理想工具。本研究首次对“黑黄金”及其亲本金钗石斛和铁皮石斛进行了cp基因组的De novo测序、组装与注释，并利用比较基因组学、系统发育分析和分子标记开发等手段，深入探究了三者的遗传特征与演化关系。

本研究采用Illumina NovaSeq平台对三个物种进行高通量测序，使用GetOrganelle进行基因组组装，并通过CpGAVAS2和GeSeq进行注释。重复序列分析使用REPuter和MISA软件，密码子使用偏好通过CodonW评估。系统发育树构建基于最大似然法（ML）和邻接法（NJ），分化时间估算采用MEGA X软件，分子标记验证通过PCR扩增和双向测序完成。样本来源于中国云南龙陵县石斛研究所。

叶绿体基因组特征

研究显示，“黑黄金”、金钗石斛和铁皮石斛的cp基因组大小分别为152,105 bp、150,620 bp和152,114 bp，均呈现典型的四分体结构，包括大单拷贝区（LSC）、小单拷贝区（SSC）和一对反向重复区（IRa/Irb）。GC含量在37%–38%之间，IR区因含有rRNA基因而GC含量较高（43.4%）。基因数量为123–199个，包括73–77个蛋白编码基因（PCGs）、38–39个tRNA基因和8个rRNA基因。与大多数被子植物一致，chlB、chlL、ycf68和ndhF基因缺失，且trnfM-CAU tRNA基因也未发现。这些结果表明三者的cp基因组在结构和组成上高度保守。

IR区的收缩与扩张

IR区与LSC/SSC边界的比较分析发现，trnH基因完全位于IRa区，而trnN和rps19基因在IR区内重复存在。ycf1基因在D. fimbriatum、D. hercoglossum和D. huoshanense中发生重复，但在“黑黄金”及其亲本中未出现，说明后者未发生显著的IR区扩张或收缩。这一发现进一步证实了“黑黄金”cp基因组的稳定性。

密码子使用偏好性与氨基酸频率

密码子使用分析显示，亮氨酸（Leu）使用频率最高，而半胱氨酸（Cys）最低。共有30个密码子的相对同义密码子使用值（RSCU）大于1.00，表明这些密码子使用过度。GC3s（同义第三位密码子GC含量）值为35.50%–36.32%，表明密码子结尾偏向A/U。Enc（有效密码子数）值为54.75–55.16，CAI（密码子适应指数）和Fop（最优密码子频率）较低，说明密码子使用偏好性较弱。

重复序列分析

在三者cp基因组中共识别出101个长重复序列，包括65个回文重复（P）、27个正向重复（F）、7个反向重复（R）和2个互补重复（C）。简单重复序列（SSR）分析表明，单核苷酸重复（A/T）占比最高（56%），主要分布在LSC区（58.33%）和非编码区。这些SSR为开发高特异性分子标记提供了基础。

比较基因组学与核苷酸多样性

mVISTA比较显示，蛋白编码区高度保守，而非编码区变异较大。滑动窗口分析识别出8个高变区（Pi>0.01），其中trnN-rpl32变异最高（Pi=0.077），psbK、accD-psaI、psbB-psbT和ndhE-rps15变异较低（Pi=0.01）。这些高变区可作为潜在的分子标记。

分子标记开发与验证

研究人员从高变区中筛选出7个候选标记（如psbK-psbI、accD-psaI等），并设计特异性引物进行PCR验证。结果显示，accD-psaI和matK-rps16能有效区分“黑黄金”与其亲本及近缘种（如D. devonianum、D. huoshanense等），证实了这两个标记在物种鉴定中的可靠性和广泛应用潜力。

系统发育分析

基于38种石斛的cp基因组构建的ML和NJ系统发育树表明，“黑黄金”与铁皮石斛聚为一支，而金钗石斛形成独立分支，证实铁皮石斛为“黑黄金”的母本。分析还发现，Sect. Breviflores和Sect. Holochrysa可能应并入Sect. Dendrobium，建议根据形态与生态特征对现有分类系统进行修订。

分化时间估算

分子钟估算显示，石斛属冠群分化时间约为29.22百万年前（Mya）。中新世至上新世的气候变化与青藏高原隆升可能促进了石斛属的多样化进程。这一发现为了解石斛属的起源与演化提供了重要线索。

本研究首次报道了“黑黄金”的cp基因组，并通过比较基因组学与分子标记开发，为其准确鉴定提供了可靠方案。系统发育分析明确了其母本来源，分化时间估算揭示了石斛属的演化历史。研究成果不仅丰富了石斛属的基因组数据，也为杂交种质资源保护与利用奠定了科学基础。未来研究可进一步整合核基因组数据，以更全面揭示石斛杂交种的遗传特性。