中国仙茅科植物叶绿体基因组比较分析揭示系统发育关系与分子标记开发

　　本研究针对仙茅科(Hypoxidaceae)植物分类混乱及野生药用资源误用问题，通过对中国产6种仙茅科植物进行叶绿体全基因组测序和比较分析，揭示了该科植物的系统发育关系，确认了仙茅科为单系群，与Asteliaceae构成姐妹群关系，并发现5个高变异分子标记(psbK-psbI、rpoB-trnC、ndhF-rpl32、ycf1和trnE-trnT)可用于药材鉴定，为传统药材市场物种鉴别和该科系统分类研究提供了重要基因组学依据。

　　

在植物分类学领域，仙茅科(Hypoxidaceae)植物一直是个令人困惑的群体。这个主要分布在南半球的植物家族，拥有约11属200种植物，其中许多都具有重要的药用和观赏价值。然而，由于研究关注度不足，仙茅科植物的分类问题一直悬而未决，特别是在传统药材市场上，野生资源的错误鉴定和误用情况屡见不鲜。

更令人头疼的是，仙茅科在分类系统中的位置一直存在争议。早期的形态学研究认为它与兰科(Orchidaceae)植物有亲缘关系，而分子系统学研究却将其归入"低级天门冬目"(lower Asparagales)的Astelioid支系中。科内的属间关系更是混乱，尤其是仙茅属(Curculigo)和Molineri属的划分界限模糊不清，物种在这两个属间来回移动成了家常便饭。

为了解决这些争议，西南林业大学的Ma Dong和Tian Qin等研究人员对中国产的6种仙茅科植物进行了深入的叶绿体基因组研究。这些植物包括Hypoxis aurea、Curculigo orchioides以及四种Molineria属植物(M. capitulata、M. crassifolia、M. sinensis和M. breviscapa)。研究成果发表在《BMC Plant Biology》期刊上，为仙茅科植物的分类和鉴定提供了新的基因组学见解。

研究人员采用Illumina HiSeq 2500平台进行全基因组测序，使用GetOrganelle软件进行叶绿体基因组组装，通过CPGAVAS2在线工具和Geneious Prime软件进行基因组注释。利用MISA和REPuter软件分别进行简单序列重复(SSR)和长序列重复(LSR)分析，采用MEGA11软件分析密码子使用偏好，通过mVISTA和DnaSP软件进行序列变异分析，最后使用IQ-TREE2软件基于最大似然法构建系统发育树。

叶绿体基因组的一般特征

研究人员发现六个叶绿体基因组长度在157,472 bp到158,550 bp之间，都具有典型的四部分结构，包含一个大单拷贝区(LSC)和一个小单拷贝区(SSC)，两者由两个反向重复区(IR)分隔。GC含量高度保守，在37.3%到37.5%之间。六个叶绿体基因组共享132个基因，包括86个蛋白质编码基因、8个rRNA和38个tRNA编码基因。重要的是，研究人员在所有六个基因组中都发现了完整的ndh基因(ndh A-K)，这与某些天门冬目植物(如部分兰科植物)中ndh基因缺失的情况形成鲜明对比。

重复序列分析

简单序列重复(SSR)分析显示，Molineria breviscapa的SSR数量最多(92个)，而Hypoxis aurea的最少(82个)。六种基因组中均检测到四种类型的SSR：单核苷酸(P1)、二核苷酸(P2)、三核苷酸(P3)和四核苷酸(P4)。长序列重复(LSR)分析发现了48-72个LSR，主要分布在30-40 bp长度范围内。基于重复序列的聚类分析将六个物种分为三组：Hypoxis aurea单独成组；Curculigo orchioides和Molineria capitulata为一组；其余三种Molineria物种为另一组。

密码子使用偏好分析

相对同义密码子使用(RSCU)分析显示，六个叶绿体基因组包含64个同义密码子编码21种氨基酸。亮氨酸(Leu)的密码子数量最多(2,036-2,086)，而色氨酸(Trp)的最少(367-375)。基于RSCU值，六个叶绿体基因组可分为两组：Hypoxis aurea和Curculigo orchioides为一组；四种Molineria物种为另一组。

IR区扩张和收缩

比较分析发现IR边界位置和相邻基因在六个叶绿体基因组中具有四个边界。四个Molineria物种具有相同的IR边界，而Hypoxis aurea和Curculigo orchioides则各自具有独特的IR边界配置，这与属级分类水平的变化相一致。

变异热点识别

通过mVISTA分析发现IR区比LSC和SSC区更稳定，这与高度保守的rRNA基因的存在有关。多态性分析显示编码区的Pi值范围为0到0.0202，平均为0.0061。有三个编码区的Pi值超过0.015：petG、rpl33和ycf1。基因间区的Pi值范围为0.001到0.0898，平均为0.0178。有两个基因间区的Pi值超过0.04：trnC-GCA-petN和trnE-UUC-trnT-GGU。

系统发育分析

基于完整的叶绿体基因组编码序列(CDS)构建的最大似然(ML)系统发育树包含61个样本，代表天门冬目的10个科。分析强烈支持(UFBoot: 96-100%)每个科的成员分别聚集成 distinct 的支系。十个科聚集成"高级天门冬目"(higher asparagoid)和"低级天门冬目"(lower asparagoid)。"高级天门冬目"包括天门冬科(Asparagaceae s.l.)和石蒜科(Amaryllidaceae s.l.)，而"低级天门冬目"则包含其余八个科。

ML系统发育树强烈支持(UFBoot: 100%)兰科(Orchidaceae)作为最早分化的支系，是所有其他天门冬目植物的姐妹群。在剩余的支系中，仙茅科与Asteliaceae在"低级天门冬目"中形成姐妹关系，而石蒜科s.l.和天门冬科s.l.在"高级天门冬目"中解析为姐妹支系。

在仙茅科内，所有16个样本形成了强烈支持的单系群(UFBoot: 100%)，包含三个明确界定的支系：仙茅支系(Curculigo clade，100%支持)、Hypoxis支系(100%支持)和Pauridia-Empodium支系(78%支持)。

为了进一步研究仙茅属和Molineria属间的系统发育关系，研究人员基于四个DNA区域(rbcL、matK、trnL-trnF和trnS-trnG)重建了另一个ML系统发育树。分析将这些分类群分为三个强烈支持的支系：仙茅支系(UFBoot: 100%)、Hypoxis支系(UFBoot: 100%)和Pauridia-Empodium支系(UFBoot: 88%)。仙茅支系包含来自五个属的21个物种，Hypoxis支系包含两个Hypoxis物种，Pauridia-Empodium支系包括来自Pauridia和Empodium的三个物种。

在仙茅支系内，识别出了三个子支系：Molineria子支系(UFBoot: 96%)、仙茅子支系(UFBoot: 97%)和塞舌耳子支系(Seychellean subclade，UFBoot: 87%)。塞舌耳子支系是其他子支系(Molineria和仙茅)的姐妹群。仙茅子支系由八个仙茅物种一致组成，塞舌耳子支系包括三个塞舌耳特有物种。然而，Molineria子支系包含了七个Molineria物种、两个婆罗洲仙茅物种(Curculigo erecta和C. racemosa)和Sinocurculigo taishanica。

研究结论与讨论

本研究首次对仙茅科六个物种的完整叶绿体基因组进行了详细测序和分析，包括基因组一般数据、重复序列、密码子使用、IR区扩张收缩、结构比较和变异热点识别分析以及系统发育分析。比较分析显示四个Molineria物种的叶绿体基因组高度一致，但在属级水平上(如Hypoxis aurea和Curculigo orchioides)变化很大。

研究人员筛选出了五个分子标记(psbK-psbI、rpoB-trnC、ndhF-rpl32、ycf1和trnE-trnT)用于仙茅科药材的鉴定。系统发育分析证实仙茅科是一个单系群，包含三个主要支系，与Asteliaceae构成姐妹关系，基于叶绿体基因组数据的支持度比以往研究更强。

研究结果显示当前仙茅科的属间界限，特别是仙茅属和Molineria属之间，需要重新评估。本文提供的系统发育证据，结合 distinct 的叶绿体基因组特征，支持Molineria子支系与仙茅子支系分开，并通过将Sinocurculigo taishanica和两个婆罗洲仙茅物种转移到Molineria来维持其单系性。

这项研究不仅为解决仙茅科植物分类争议提供了重要的基因组学证据，还为传统药材市场上仙茅科植物的准确鉴定提供了实用的分子工具，对保护野生资源和确保药材质量具有重要意义。未来的研究应该通过在南半球中心分布区进行广泛采样，增加更多的基因组数据，以更好地理解仙茅科属间系统发育关系。