神经颗粒素与MYH9互作调控脑血管细胞骨架重塑的新机制及其在阿尔茨海默病中的潜在意义

　　本研究针对神经颗粒素（Ng）在脑血管中的未知功能展开探索。研究人员通过免疫沉淀-质谱联用技术（IP-MS）揭示了Ng与肌球蛋白重链9（MYH9）在脑微血管内皮细胞中的新型钙离子依赖性互作，证实该互作通过调控细胞骨架重塑、影响AKT-GSK3β信号通路及血管内皮激活标志物VCAM1表达，进而参与血脑屏障完整性维持。Ng基因敲除小鼠模型进一步验证了Ng缺失导致脑血管结构紊乱及MYH9表达下调。该研究为阿尔茨海默病等神经系统疾病的血管病理机制提供了新视角。

　　

在大脑的精密调控系统中，血脑屏障（Blood-Brain Barrier, BBB）犹如一道严密的防线，选择性控制物质进出中枢神经系统，维持脑内环境稳定。这道屏障主要由脑微血管内皮细胞及其间的紧密连接构成，其结构完整性对神经功能至关重要。然而，在阿尔茨海默病（Alzheimer's Disease）等神经系统疾病中，血脑屏障常常出现功能障碍，导致神经毒性物质渗入脑实质，加速疾病进展。尽管科学家们已认识到血管病变在神经退行性疾病中的重要作用，但调控血脑屏障完整性的分子机制仍有许多未知之处。

近年来，一种名为神经颗粒素（Neurogranin, Ng）的蛋白质引起了研究者的关注。Ng最初在神经元中被发现，作为钙离子（Ca²⁺）/钙调蛋白（Calmodulin, CaM）信号通路的关键调节因子，参与突触可塑性和学习记忆过程。临床研究表明，Ng表达水平降低与阿尔茨海默病和精神分裂症的发病密切相关。令人惊讶的是，Ng不仅在神经元中表达，也存在于脑血管系统中，但其在血管内皮细胞中的功能却鲜为人知。探索Ng在血脑屏障中的作用机制，可能为理解神经系统疾病的血管病理机制提供新思路。

为了揭开Ng在脑血管中的神秘面纱，Akande等研究人员在《Fluids and Barriers of the CNS》上发表了他们的最新研究成果。研究团队采用人脑微血管内皮细胞系（hCMEC/D3）作为血脑屏障的体外模型，通过免疫沉淀-质谱联用技术（Immunoprecipitation-mass spectrometry, IP-MS）分别在高铁离子和低钙离子条件下解析了Ng的相互作用组。他们意外地发现了一种前所未有的相互作用——Ng与肌球蛋白重链9（Myosin Heavy Chain 9, MYH9）的结合，这种结合在高铁离子条件下尤为显著。

研究人员为深入探索这一现象，综合运用了钙调蛋白亲和下拉实验（CaM affinity pulldown）、邻近连接 assay（Proximity Ligation Assay, PLA）、基因敲降（siRNA）和过表达技术，以及Ng基因敲除小鼠模型。这些方法揭示了Ng-MYH9互作如何通过调节细胞骨架重塑影响血脑屏障功能。

研究结果首先通过IP-MS技术揭示了Ng的钙离子依赖性互作组。在高钙条件下，Ng与116种蛋白质结合，而在低钙条件下仅与34种蛋白质结合。MYH9作为其中最显著的相互作用蛋白，在高钙条件下与Ng的结合亲和力显著增强。Western blot验证实验进一步证实了MYH9和肌球蛋白磷酸酶Rho相互作用蛋白（MPRIP）在高钙条件下特异性与Ng结合。

通路分析显示Ng结合蛋白主要富集于上皮粘附连接信号、EIF2信号通路、Rho介导的肌动蛋白运动调控等与细胞骨架重塑密切相关的通路。这些发现提示Ng可能通过调节细胞骨架动态影响血管内皮功能。

钙调蛋白互作组的蛋白质组学分析揭示了858种与CaM结合的蛋白质，其中571种在高钙条件下结合，280种在两种条件下都能结合。值得注意的是，IQ基序包含的GTP酶激活蛋白1（IQGAP1）和MYH9在高钙条件下与CaM的结合亲和力更高，而Ng主要在低钙条件下与CaM结合。PLA实验直观地展示了细胞内Ng与CaM及Ng与MYH9的相互作用，其中Ng-MYH9的相互作用信号显著强于CaM-MYH9。

聚类分析确定了46种只与Ng结合的蛋白质和73种同时与Ng和CaM结合的蛋白质。这些蛋白质主要参与Hsp90、Akt和PI3K通路，以及肌动蛋白细胞骨架信号、Rho介导的肌动蛋白运动调控和上皮粘附连接信号等关键通路。

细胞内Ng与MYH9相互作用的研究通过PLA技术得到了证实，结果显示Ng-MYH9相互作用明显多于Ng-CaM相互作用。功能实验表明，Ng敲降和过表达均显著降低了F-肌动蛋白（F-actin）水平，但不影响MYH9表达。Phalloidin染色显示Ng敲降导致F-肌动蛋白分布由细胞周边富集模式变为弥散胞内分布，荧光强度显著降低。

MYH9表达调控的研究发现，MYH9敲降不仅降低了Ng和F-肌动蛋白表达，还减少了AKT和GSK3β磷酸化，增加了血管细胞粘附分子1（VCAM1）表达，降低了claudin-1和ZO2等紧密连接蛋白水平。这些变化与Ng敲降的表型相似，表明MYH9可能位于Ng上游或与之平行发挥作用。

体内实验结果显示，Ng基因敲除小鼠皮质血管中MYH9表达显著降低，CD31染色模式紊乱，表明Ng缺失导致脑血管结构异常。

研究结论与讨论部分指出，这项研究首次揭示了Ng在脑微血管内皮细胞中通过MYH9依赖的机制调控细胞骨架重塑。与传统认知中Ng主要作为CaM缓冲剂的功能不同，本研究发现了Ng在脑血管中的新作用模式——通过直接与MYH9相互作用，影响肌动蛋白-肌球蛋白复合物的形成和功能，进而调节细胞骨架动态和血脑屏障完整性。

MYH9作为非肌肉肌球蛋白重链IIA（NMMIIA），是细胞运动、极化和形态发生的关键调节因子。本研究证明Ng-MYH9互作通过调节AKT-GSK3β信号通路和紧密连接蛋白表达，影响内皮细胞激活状态和屏障功能。Ng表达水平的变化（无论是敲降还是过表达）都会破坏F-肌动蛋白的平衡，表明维持适当的Ng表达水平对血管稳态至关重要。

这些发现对理解阿尔茨海默病的病理机制具有重要意义。已知阿尔茨海默病患者脑中Ng表达降低，本研究提示这种降低可能通过破坏血脑屏障完整性，加速疾病进展。Ng-MYH9轴可能成为治疗神经系统疾病血管并发症的新靶点。

该研究的创新之处在于突破了Ng仅在神经元中发挥功能的传统观念，揭示了其在脑血管系统中的重要作用，并发现了Ng-MYH9这一全新的相互作用对。多方法验证策略（从蛋白质组学到体内外功能实验）为结论提供了坚实证据。未来研究需要进一步阐明Ng-MYH9互作的具体结构基础及其在阿尔茨海默病动物模型中的功能意义，为开发针对血脑屏障保护的治疗策略提供新方向。