磁性导航纳米PROTAC通过原位重编程巨噬细胞极化表型治疗急性肺损伤

　　为解决急性肺损伤(ALI)缺乏高效靶向药物治疗的问题，研究人员开发了一种新型磁性导航人工外泌体(EMPLANT)，通过负载靶向TRIM24的PROTAC降解剂(dTRIM24)，实现了肺部炎症部位的双重靶向递送。该研究证实EMPLANT能有效降解TRIM24蛋白，上调STAT6表达，促进巨噬细胞从M1向M2表型转化，显著改善ALI小鼠模型病理状况并将生存率提升至近100%。这项研究为ALI治疗提供了精准的纳米治疗新策略。

　　

急性肺损伤(ALI)是一种具有高发病率和高死亡率的急性炎症性肺疾病，目前缺乏有效的药物治疗手段，导致患者预后较差。传统抗炎药物因缺乏精准靶向性，不仅疗效有限，还易产生显著副作用。更棘手的是，ALI的炎症反应一旦触发，常呈"级联放大"效应，现有药物难以阻断中性粒细胞浸润和细胞因子风暴等关键进程。在这一背景下，巨噬细胞作为具有高度可塑性的免疫细胞，在ALI进程中扮演着关键角色。巨噬细胞可极化为经典激活的M1型或替代激活的M2型，两者具有截然不同的功能表型：M1巨噬细胞分泌IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子，加剧炎症损伤；而M2巨噬细胞则产生IL-10和TGF-β等抗炎介质，促进组织修复。研究表明，调节巨噬细胞从M1向M2表型转化，可能成为ALI治疗的潜在策略。

在这一科学背景下，TRIM24蛋白作为三重基序(TRIM)家族成员，被发现能够通过抑制STAT6乙酰化来调控巨噬细胞极化。蛋白降解靶向嵌合体(PROTAC)技术作为一种新型蛋白精准降解工具，其试剂dTRIM24可有效降解TRIM24蛋白。然而，PROTAC试剂普遍存在水溶性差、组织特异性低和生物利用度低等问题，亟需开发高效精准的递送系统。

针对这一挑战，Chen等人在《Journal of Nanobiotechnology》上发表了最新研究成果，开发了一种磁性导航的纳米PROTAC系统——EMPLANT。该系统采用聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)负载磁性纳米颗粒和dTRIM24，再伪装M1巨噬细胞来源的外泌体膜制备而成，具备磁导航和炎症特异性双重靶向能力。

研究人员主要采用了几项关键技术：通过超速离心法从LPS诱导的M1巨噬细胞中分离天然外泌体；采用双乳化法制备PLGA载药纳米粒；通过膜蛋白提取和超声挤出技术构建人工外泌体；利用纳米颗粒跟踪分析(NTA)和透射电镜(TEM)表征纳米粒理化性质；通过体外释放实验评估pH响应性释药特性；采用共聚焦显微镜和成像流式细胞术分析细胞摄取；通过Western blot和RT-qPCR评估蛋白降解和基因表达变化；建立LPS诱导的ALI小鼠模型进行体内治疗效果评价。

Preparation and characterization of exosomes

研究人员首先成功诱导RAW 264.7细胞分化为M1和M2巨噬细胞，并通过超速离心法从M1巨噬细胞条件培养基中分离出外泌体(M1-Exos)。Western blot分析证实M1-Exos高表达外泌体标志物CD63，而M1巨噬细胞总蛋白中CD63表达可忽略不计。TEM显示M1-Exos呈杯状结构，直径60-120纳米，NTA分析平均直径为80±10纳米。细胞摄取实验表明，M1-Exos能被M1巨噬细胞高效内吞，且摄取效率明显高于M2来源外泌体。

The preparation and characterizations of EMPLANT

研究人员通过双乳化法制备了PLGA负载磁性纳米颗粒和dTRIM24的PLANT纳米粒，进一步用M1-Exos膜伪装形成EMPLANT。TEM显示PLANT呈球形，直径约150纳米，而EMPLANT呈现明显的核壳结构，外壳厚度约10纳米。DLS分析显示EMPLANT的水合粒径为209±7纳米。Coomassie Brilliant Blue染色证实EMPLANT表面存在M1-Exos膜来源的特异性抗原，Western blot验证了EMPLANT表达外泌体标志物CD63和M1巨噬细胞标志物CD80。体外释放实验表明，dTRIM24在pH 5.0条件下的24小时释放速率约为生理pH(7.4)条件下的两倍，显示纳米粒具有pH响应性释药特性。

Cellular uptake

以DiD荧光染料替代dTRIM24制备的EMPLAN/DiD显示出剂量和时间依赖性的细胞内存作用，在200μg/mL(EMPLAN当量)浓度和12小时孵育条件下达到约95%的DiD阳性率。不同细胞系摄取实验表明，M1巨噬细胞对EMPLAN/DiD的摄取明显高于MLE-12肺上皮细胞和NIH-3T3成纤维细胞，证实外泌体膜伪装提高了纳米粒对M1巨噬细胞的选择性靶向能力。

Cytotoxicity and the anti-inflammatory effects in vitro

Live/Dead染色和CCK-8实验表明，EMPLANT在工作浓度范围内对M1巨噬细胞无显著细胞毒性，细胞存活率超过90%。Western blot分析显示，EMPLANT以剂量依赖性方式降解TRIM24蛋白，同时上调STAT6表达。RT-qPCR证实EMPLANT降低M1标志物iNOS表达，增加M2标志物Arg-1表达，促进巨噬细胞从M1向M2表型转化。此外，EMPLANT还显著降低促炎细胞因子IL-1β和IL-6表达，同时增加抗炎细胞因子IL-10和TGF-β表达。

The biological effects induced by different formulations

不同制剂的生物学效应评价表明，含dTRIM24的制剂(PLT、EMPLT、PLANT和EMPLANT)均能有效改变TRIM24、STAT6、iNOS和Arg-1的蛋白水平。其中，EMPLANT几乎完全降解TRIM24，导致STAT6有效表达，iNOS下调至约50%，而Arg-1大幅上调，表明M1巨噬细胞表型向M2转化。mRNA水平分析与蛋白水平一致，同时抗炎细胞因子(IL-10和TGF-β)增加，炎症细胞因子(IL-6和TNF-α)减少。

The biodistribution in vivo

体内分布实验显示，在磁场作用下，EMPLAN/DiR在ALI小鼠炎症肺部显著积累，而在肝脾中的分布较少。相反，虽然同样施加磁场，DiR、PLAN/DiR和EMPL/DiR组主要积累在肝脾，肺部信号很少。这表明EMPLANT在磁场作用下能改善在炎症肺部的积累。

The therapeutic effects on ALI mice

ALI小鼠模型治疗实验表明，在磁场存在下，EMPLANT能最有效地降解TRIM24，从而诱导最高水平的STAT6。mRNA表达证实EMPLANT降低iNOS表达，同时增加Arg-1表达，表明巨噬细胞极化从M1向M2表型转变。ELISA分析显示，与其他dTRIM24变体相比，EMPLANT联合外部磁场对促炎细胞因子的抑制和最抗炎因子的增强作用最为显著。

Hematoxylin& eosin(H&E) and immunofluorescence staining

H&E染色表明，EMPLANT在磁场存在下显著改善肺损伤，炎症细胞浸润减少。相反，盐水、dTRIM24、PLANT、EMPLT和EMPLANT(无MF)对照组显示肺组织有炎症细胞浸润，肺泡气腔减少，肺泡组织增加。免疫荧光染色也证明，M1标志物iNOS显著减少，同时M2巨噬细胞标志物Arg-1显著增加。定量分析证实，在MF存在下给予EMPLANT能更有效地增加M2标志物(Arg-1)和减少M1标志物(iNOS)。令人鼓舞的是，EMPLANT给药极大地延长了小鼠的存活率，在168小时(7天)内几乎达到100%，而盐水处理的小鼠通常在48小时内死亡。主要器官(心、肝、肾和脾)的H&E染色分析表明，不同制剂治疗没有显著变化，表明这些制剂的安全性。

该研究开发的磁性导航纳米PROTAC(EMPLANT)通过PLGA负载磁性纳米颗粒和PROTAC试剂，并伪装M1巨噬细胞来源的外泌体膜构建而成。EMPLANT能在外部磁场作用下改善PROTAC在实验性ALI小鼠炎症肺部的积累，并提高对M1巨噬细胞的特异性，从而有效减轻肺损伤并极大延长小鼠存活率。机制上，TRIM24的降解上调了STAT6的表达，从而促进巨噬细胞从M1向M2表型的有效转化。此外，EMPLANT对所有测试的PROTAC变体均表现出对促炎细胞因子的改善抑制和对抗炎细胞因子的促进作用。这种磁性导航的纳米PROTAC通过精确原位重编程巨噬细胞，为损伤性肺部炎症提供了一种有前景的治疗策略。据研究者所知，这是首次开发这种类型的磁性导航人工外泌体来递送PROTAC并用于ALI治疗。