丁酸钠靶向VWF抑制香烟烟雾提取物诱导的内皮细胞-巨噬细胞互作调控炎症反应

　　本研究聚焦慢性阻塞性肺疾病（COPD）中香烟烟雾诱导的炎症机制，探讨了短链脂肪酸丁酸钠（NaB）通过靶向血管性血友病因子（VWF）调控内皮细胞-巨噬细胞交互作用的新途径。研究人员通过网络药理学分析发现VWF是关键靶点，并利用细胞共培养模型证实NaB通过抑制VWF表达阻断PI3K-AKT信号通路激活，显著降低炎症因子水平。该研究揭示了NaB通过靶向VWF调控炎症微环境的新机制，为COPD治疗提供了新型治疗策略。

　　

在呼吸系统疾病领域，慢性阻塞性肺疾病（COPD）始终是全球性的健康挑战。作为第三大死亡原因，COPD患者数量预计在2020至2025年间增长23%，接近6亿病例，疾病负担日益加重。当前治疗方法主要依赖支气管扩张剂或广谱抗炎皮质类固醇，但这些手段仅能缓解症状，无法针对疾病根本 pathogenesis（发病机制），且疗效有限。尽管抗炎疗法尚未成为一线治疗方案，但它代表了未来COPD精准医学的潜在方向。

香烟烟雾引发的炎症是COPD进展的关键驱动因素，其中巨噬细胞增多是COPD慢性炎症的标志性特征。香烟烟雾能激活巨噬细胞的炎症反应，促进肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、CXC趋化因子配体1（CXCL1）、CXCL8和CC趋化因子配体2（CCL2）等炎症介质的分泌，进一步增强单核细胞趋化作用。研究表明，COPD患者对皮质类固醇的耐药性可能与巨噬细胞中组蛋白去乙酰化酶2（HDAC2）活性降低有关，这导致无法抑制炎症基因的过度激活。因此，探索调控巨噬细胞驱动炎症的机制，可能为发现新的抗炎靶点提供突破口。

丁酸钠（Sodium butyrate, NaB）作为一种短链脂肪酸，是肠道菌群通过膳食纤维发酵产生的代谢产物，在维持肠道健康中扮演关键角色。大量研究表明，NaB能促进免疫稳态，使其成为抗炎治疗的有力候选者。NaB在结直肠癌、脂肪肝疾病、炎症性肠病和COPD等疾病中展现出预防和治疗潜力。然而，NaB通过多个靶点调控炎症，进一步阐明其在COPD治疗中的机制，对于推动其临床转化应用至关重要。

血管性血友病因子（von Willebrand Factor, VWF）早期被确定为内皮损伤的标志物，主要参与凝血过程，但最新研究发现其也参与炎症进程。COPD患者血清中VWF水平和活性升高，并促进全身炎症进展。值得注意的是，COPD急性加重期间VWF水平显著增加。然而，迄今为止尚无研究专门探讨VWF在调控COPD进展中的具体作用。鉴于巨噬细胞在COPD相关炎症中的关键地位，本研究旨在探究VWF在香烟烟雾提取物（CSE）诱导的内皮细胞-巨噬细胞交互中的作用，并证明NaB如何靶向VWF调控COPD炎症。这些发现将为阐明NaB在COPD中治疗作用机制提供新的见解。

本研究采用了几项关键技术方法：通过GEO数据库获取GSE38974数据集进行生物信息学分析，筛选COPD差异表达基因；运用STRING数据库构建蛋白质相互作用网络并进行随机游走重启（RWR）分析；使用人间脐静脉内皮细胞（HUVECs）和THP-1细胞系建立体外细胞模型；通过小干扰RNA（siRNA）敲减和过表达质粒转换技术调控VWF表达；采用Transwell共培养系统研究细胞间通讯；通过ELISA、qRT-PCR和Western blot等技术检测炎症因子和信号通路蛋白表达；使用CCK-8法和流式细胞术评估细胞活力和凋亡情况。

VWF是丁酸钠治疗COPD的潜在靶点

通过生物信息学分析，研究团队从GSE38974数据集中鉴定出1764个COPD相关差异表达基因，包括658个上调基因和1106个下调基因。通过在线数据库预测NaB的潜在靶点，获得35个潜在靶点。差异表达基因与预测靶点的交集显示，GABBR1和VWF可能是NaB调控COPD的潜在靶点。由于COPD患者VWF水平升高与上皮损伤、肺气肿、急性加重和死亡风险增加相关，研究选择VWF作为NaB在COPD中的潜在靶点进行深入分析。

研究人员利用差异表达基因和NaB潜在靶点构建了蛋白质相互作用（PPI）网络，然后以VWF为种子进行RWR分析。根据亲和力评分筛选前50个基因进行功能富集分析，结果表明血管生成调控、细胞-基质连接、细胞因子活性和PI3K-AKT信号通路与VWF密切相关。

丁酸钠减轻CSE诱导的HUVEC凋亡和VWF表达

由于VWF主要由血管内皮细胞产生，本研究采用HUVECs进行初步探索。为模拟COPD研究环境，用CSE处理HUVECs 24小时。结果显示，CSE以浓度依赖性方式降低细胞活力，2.5%及以上浓度显著降低细胞活力，因此选择2.5% CSE用于后续实验。

研究发现NaB显著增强HUVECs活力，并在CSE刺激下保持这种保护作用。此外，CSE处理显著促进HUVECs凋亡，而NaB的添加部分逆转了这一效应。qRT-PCR和Western blot分析显示，CSE显著上调VWF的mRNA和蛋白表达水平，而NaB处理显著抑制了CSE引起的这种上调。

CSE诱导的HUVECs中VWF高表达可促进巨噬细胞炎症反应

由于血管内皮细胞与巨噬细胞之间存在细胞间通讯，并且文献报道VWF在巨噬细胞激活和炎症反应中起关键作用，研究团队构建了转染si-NC和si-VWF的HUVECs，选择转染效率最佳的HUVECs与THP-1巨噬细胞共培养。

结果显示，VWF敲减显著减弱了内皮细胞中VWF蛋白的分泌。当与巨噬细胞共培养时，这些VWF缺陷的内皮细胞进一步抑制了巨噬细胞分泌促炎细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-8。在CSE处理下，共培养系统中VWF和炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-8水平显著升高。巨噬细胞中IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-8的表达也显著上调。

有趣的是，当在共培养前使用si-VWF敲减HUVECs中的VWF时，巨噬细胞和共培养系统中IL-1β、TNF-α和IL-6水平部分恢复，而IL-8水平无显著变化。这些发现表明，在CSE刺激下，HUVECs中过表达的VWF可促进巨噬细胞的炎症反应。此外，CSE诱导的HUVECs分泌的VWF似乎不影响巨噬细胞产生IL-8。

CSE诱导的HUVECs中VWF高表达可激活巨噬细胞中的PI3K-AKT信号通路

基于RWR和功能富集分析，研究团队发现PI3K-AKT信号通路是NaB靶向VWF治疗COPD的潜在机制。首先检测了内皮VWF敲减对巨噬细胞PI3K-AKT信号的影响，结果显示内皮细胞中VWF缺陷显著降低了巨噬细胞中磷酸化PI3K（p-PI3K）和磷酸化AKT（p-AKT）水平。

此外，研究发现CSE刺激下，巨噬细胞中p-AKT和p-PI3K蛋白表达显著增加。然而，当敲减HUVECs中的VWF时，共培养系统中巨噬细胞内p-AKT和p-PI3K的表达受到抑制。这些结果表明，在CSE刺激下，HUVECs产生的VWF可激活巨噬细胞中的PI3K-AKT信号通路。

丁酸钠通过抑制VWF减少CSE诱导的巨噬细胞炎症反应和PI3K-AKT信号通路激活

为进一步研究VWF是否是NaB调控内皮细胞-巨噬细胞交互作用的关键靶点，研究团队使用转染oe-VWF的HUVEC细胞系进行功能回复实验。

首先，每组HUVECs用NaB或生理盐水预处理24小时，然后将预处理的HUVECs与THP-1巨噬细胞共培养。结果显示，NaB预处理显著下调共培养系统中VWF、IL-1β、TNF-α和IL-6的表达水平。然而，VWF过表达逆转了VWF、IL-1β、TNF-α和IL-6的表达水平。qRT-PCR分析显示，共培养后巨噬细胞中IL-1β、TNF-α和IL-6的mRNA水平呈现相同趋势。

同时，NaB预处理显著抑制巨噬细胞中PI3K-AKT信号通路的激活，而VWF过表达重新激活了PI3K-AKT信号通路。VWF过表达部分逆转了NaB对PI3K-AKT信号通路的抑制作用。这些发现证明，NaB可通过靶向VWF缓解CSE诱导的内皮细胞-巨噬细胞交互作用，从而减少巨噬细胞炎症反应和PI3K-AKT信号通路激活。

丁酸钠通过抑制VWF减轻CSE诱导的内皮细胞损伤

为研究巨噬细胞在内皮细胞损伤中的调控作用，研究团队检测了巨噬细胞存在/缺失以及NaB对CSE暴露内皮细胞中VE-钙粘蛋白（VE-cadherin）表达和细胞通透性的影响。

结果显示，CSE降低了内皮细胞中VE-cadherin表达，而NaB上调其表达。在基础条件下，巨噬细胞共培养不影响内皮细胞中VE-cadherin表达。然而，在CSE处理组中，这种共培养显著下调了VE-cadherin蛋白水平。NaB恢复了CSE/巨噬细胞诱导的VE-cadherin抑制。值得注意的是，VWF过表达不仅增强了CSE和巨噬细胞对内皮VE-cadherin的协同抑制作用，而且消除了NaB的恢复作用。

相反，CSE显著增加内皮通透性，而NaB对该参数无直接影响。巨噬细胞共培养进一步增强了通透性升高，这种效应在CSE刺激下显著放大。重要的是，NaB有效抑制了CSE/巨噬细胞诱导的内皮通透性增强。值得注意的是，VWF过表达不仅增强了CSE和巨噬细胞对通透性增加的协同效应，而且消除了NaB的保护作用。总之，NaB主要通过靶向VWF抑制CSE触发的巨噬细胞炎症来保护内皮屏障完整性。

研究结论与意义

本研究通过系统的实验验证和机制探讨，证实了丁酸钠通过靶向血管性血友病因子抑制香烟烟雾提取物诱导的内皮细胞-巨噬细胞交互作用，从而调控炎症反应的创新机制。

研究发现，CSE诱导的人脐静脉内皮细胞中VWF高表达能够激活巨噬细胞炎症反应和PI3K-AKT信号通路。这些激活的巨噬细胞进一步加剧CSE诱导的内皮细胞损伤。NaB能够抑制CSE诱导的VWF表达，从而抑制CSE诱导的内皮细胞-巨噬细胞交互作用，减轻巨噬细胞炎症和内皮损伤。

该研究的创新点在于首次揭示了VWF在CSE诱导的内皮细胞-巨噬细胞交互中的关键调控作用，并阐明了NaB通过靶向VWF-PI3K-AKT轴调控炎症微环境的新机制。这些发现不仅深化了对COPD炎症机制的理解，而且为开发新的治疗策略提供了理论依据和实验基础。

值得注意的是，最近批准的COPD治疗药物ensifentrine通过稳定VE-cadherin连接和抑制促炎信号减轻MRSA诱导的内皮损伤，该机制与本研究中NaB的保护作用存在显著平行性。因此，研究它们的潜在协同效应可能具有重要的治疗价值。

尽管本研究存在一些局限性，如仅在体外细胞模型中验证 proposed机制，缺乏体内动物模型验证，且未明确VWF介导的巨噬细胞激活是否完全依赖PI3K-AKT通路，但这些发现仍为COPD治疗提供了新的思路和靶点。未来研究可进一步探索NaB与其他治疗药物的联合应用，以及其在临床COPD患者中的治疗效果，为推动COPD精准治疗提供更多科学依据。