SOD1D90A突变的外泌体蛋白质组学研究揭示了疾病的早期机制，同时发现FN1可作为生物标志物

《Annals of Clinical and Translational Neurology》：Exosome Proteomics of SOD1D90A Mutation Suggest Early Disease Mechanisms, and FN1 as a Biomarker

　　外泌体蛋白质组学揭示SOD1 D90A突变家族中纤维连接蛋白1（FN1）水平随疾病进展递增，并与ALSFRS评分显著负相关，提示其作为神经肌肉退行性疾病生物标志物的潜力。通过对比无症状女儿、早期症状儿子及晚期患者血清外泌体蛋白谱，结合 IPA 通路分析，发现疾病不同阶段涉及血脑屏障稳定性、DNA修复、线粒体损伤及神经免疫激活等动态变化。ELISA验证显示血清FN1浓度与ALSFRS评分呈剂量-效应关系，且该模式在携带不同突变（TDP-43 G348C、PABPN1 intron expansion）的对照组中同样成立。

　　### 背景与研究目的

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种复杂的神经肌肉疾病，影响大脑和脊髓的运动神经元。这种疾病可以分为家族性ALS和散发性ALS，前者是由遗传突变引起的，而后者则没有明确的遗传原因。近年来，科学家们发现多个基因与ALS有关，其中超氧化物歧化酶1（SOD1）是最早被鉴定为导致ALS的基因之一。SOD1基因突变会引发“毒性获得”，即突变的蛋白质可能对神经元产生有害影响。因此，针对SOD1突变的治疗策略，如反义寡核苷酸（ASO）技术，正在成为研究的热点。Qalsody是一种基于ASO技术的药物，专门用于治疗携带SOD1突变的ALS患者，已被批准用于美国、欧洲和日本，并在全球范围内逐渐普及。

为了更好地理解疾病的发展过程并开发新的药物监测指标，本研究选取了一组具有相同SOD1突变的家族成员，包括父亲、儿子和女儿，他们分别处于不同的疾病阶段。同时，还纳入了一位患有相同突变但病情更严重的患者（患者#2），以便进行更全面的比较。通过分析这些患者血清中的外泌体蛋白组，研究人员希望揭示ALS早期的细胞变化，并确定潜在的药代动力学生物标志物。

### 方法概述

外泌体是从血清中分离出来的微小细胞外囊泡，携带多种蛋白质和生物分子。它们在细胞间通讯和信号传递中发挥重要作用，能够将信息传递到不同的组织和器官。因此，外泌体被认为是研究疾病状态的重要工具。研究人员采用了一种基于串联质谱（Tandem Mass Spectrometry, MS）的蛋白质组学方法，对血清中的外泌体进行定量分析。此外，还使用了Ingenuity Pathway Analysis（IPA）工具，用于识别与疾病进展相关的细胞通路和功能变化。通过线性回归分析，研究人员将ALSFRS评分与外泌体中蛋白质浓度的变化联系起来，以寻找可能的药代动力学生物标志物。最终，这些发现通过ELISA实验进行了验证。

### 研究对象与样本处理

本研究的参与者包括一名携带SOD1^D90A突变的父亲、儿子和女儿，他们分别处于不同的疾病阶段。父亲在研究时已经出现症状，且病程超过两年；儿子在一年内从无症状状态发展为有症状；女儿则在整个研究期间保持无症状。此外，还纳入了一名患有相同SOD1^D90A突变但病情更严重的患者（患者#2），他的ALSFRS评分较低，表明病情进展更为严重。为了确保研究的可靠性，研究人员还选择了年龄和性别匹配的对照组，用于ELISA实验。通过外泌体的分离和确认，研究人员确保了所分析的样本具有代表性。

在样本处理过程中，血清样本通过特定的流程进行处理，包括离心、过滤和使用ExoEasy试剂盒进行外泌体的提取。外泌体的纯度和完整性通过电子显微镜（EM）进行确认，确保其为真实的外泌体。随后，通过蛋白提取和质谱分析，研究人员获得了外泌体中的蛋白质信息。为了确保分析的准确性，他们使用了多种软件工具，如Sequest、Mascot、X! Tandem和OMSSA，对蛋白质进行鉴定。这些工具的结合使得研究能够以较高的置信度识别出与疾病相关的蛋白质变化。

### 蛋白质组学分析与细胞变化

通过蛋白质组学分析，研究人员发现不同阶段的患者外泌体中的蛋白质组成存在显著差异。例如，在女儿的外泌体中，虽然她尚未出现症状，但已经出现了多个细胞通路的变化，包括与血脑屏障（BBB）稳定性、DNA修复和神经免疫反应相关的通路。这些变化表明，即使在无症状阶段，ALS的病理过程已经开始，并且机体正在努力维持细胞稳态。然而，随着疾病的发展，儿子和父亲的外泌体中出现了更多与免疫反应、组织损伤和细胞死亡相关的通路。

在儿子的外泌体中，蛋白质变化更加显著，尤其是在他从无症状发展为有症状的阶段。研究人员发现，补体级联反应、TRIM21信号通路和免疫调节相关通路的激活，可能反映了神经免疫反应的启动。这些变化与线粒体功能障碍有关，表明在症状出现前，线粒体损伤可能已经发生，并且机体正在通过激活免疫反应来应对这种损伤。此外，儿子的外泌体中还出现了与神经胶质细胞反应相关的蛋白质变化，这可能与神经退行性变有关。

父亲的外泌体中，随着疾病进展，更多的蛋白质变化被检测到，尤其是与组织损伤和细胞死亡相关的通路。例如，补体级联反应的激活和吞噬作用的增强，表明在疾病晚期，免疫系统可能对受损组织产生更强的反应。此外，父亲的外泌体中还出现了与DNA修复和细胞凋亡相关的通路，这些变化可能与神经元的进一步退化有关。相比之下，女儿的外泌体中仍然存在较多与DNA修复和细胞稳态相关的蛋白质，这可能意味着她的机体尚未完全进入疾病晚期。

### 药代动力学生物标志物的发现

在所有分析中，Fibronectin1（FN1）是一个显著的发现。FN1是一种主要存在于细胞外基质中的糖蛋白，参与细胞迁移、血液凝固和宿主防御等多种生理过程。通过线性回归分析，研究人员发现FN1的水平随着疾病进展而逐渐升高，尤其是在ALSFRS评分下降时。这一趋势在儿子、父亲和患者#2的样本中均得到了验证，表明FN1可能是一个有效的药代动力学生物标志物。

此外，研究人员还分析了FN1的不同亚型，并发现其中某些亚型（如亚型2、4、5、6、7、8和9）的水平也随着疾病进展而升高。这进一步支持了FN1作为疾病进展标志物的潜力。值得注意的是，FN1在ALS患者的外泌体中被多次检测到，尤其是在脊髓和大脑组织中，这可能与其在维持血脑屏障稳定性中的作用有关。因此，FN1的水平变化可能反映了血脑屏障的破坏程度，从而成为监测ALS进展的一个重要指标。

### 研究的意义与未来方向

本研究的意义在于揭示了ALS早期的细胞变化，并发现了FN1作为潜在的药代动力学生物标志物。通过分析同一家族成员的外泌体，研究人员能够观察到疾病从无症状到有症状的动态过程，并进一步探讨了不同阶段的蛋白质变化。这些发现不仅有助于理解ALS的发病机制，还为疾病的早期诊断和干预提供了新的思路。

未来的研究可以进一步扩大样本量，验证FN1在更广泛ALS患者群体中的适用性。此外，研究人员还可以探索FN1是否对药物治疗有反应，从而作为治疗效果的监测指标。结合生物信息学和人工智能技术，可以更深入地分析外泌体中的蛋白质网络，揭示更多与疾病相关的分子机制。此外，其他与ALS相关的生物标志物也可能被发现，为个性化治疗提供支持。

### 总结

本研究通过分析同一家族成员和不同病情阶段的ALS患者的外泌体，揭示了ALS早期的细胞变化，并发现了FN1作为潜在的药代动力学生物标志物。FN1的水平随着疾病进展而升高，尤其是在ALSFRS评分下降时，表明其可能在疾病监测中发挥作用。这些发现为ALS的早期诊断、治疗效果评估和个体化治疗提供了新的方向。通过进一步的研究，FN1和其他相关生物标志物可能成为未来ALS治疗的重要工具。