长春西汀通过靶向P-gp/MDR1与PDE1C通路逆转三阴性乳腺癌紫杉醇耐药性研究

　　本研究揭示膳食补充剂长春西汀（Vinpocetine）通过双重机制克服三阴性乳腺癌（TNBC）紫杉醇（Paclitaxel）耐药：抑制多药耐药蛋白P-gp/MDR1介导的药物外排，并调控磷酸二酯酶PDE1C-cAMP-Ca2+通路增强微管稳定性。该发现为TNBC耐药治疗提供了新策略。

　　

研究背景与意义

紫杉醇作为三阴性乳腺癌（TNBC）的一线化疗药物，通过结合微管蛋白促进微管聚合与稳定，破坏有丝分裂纺锤体组装，最终诱导细胞死亡。然而，肿瘤细胞易产生耐药性，导致治疗失败。耐药机制包括药物外排泵P-糖蛋白（P-gp/MDR1）高表达、细胞生存通路上调、微管动态改变等。长春西汀是一种从长春花中提取的半合成生物碱衍生物，具有良好的血脑屏障穿透性和安全性，既往用于脑血管疾病和认知障碍治疗。近年研究发现其具有抗肿瘤潜力，可能通过抑制磷酸二酯酶1（PDE1）、调节离子通道和炎症通路发挥作用。本研究旨在探索长春西汀能否逆转TNBC细胞对紫杉醇的耐药性及其分子机制。

材料与方法

实验采用MDA-MB-231 TNBC细胞系，通过逐步递增紫杉醇浓度（0.5–50 nM）诱导建立耐药细胞株T50RN。细胞毒性通过台盼蓝排斥试验和集落形成 assay 评估；线粒体膜电位采用TMRE染色检测；活性氧（ROS）水平使用CellROX Green和MitoSox Red试剂测定；微管聚合质量通过免疫荧光染色及ImageJ软件"Tubeness"插件量化；P-gp功能通过罗丹明123积累与外排实验验证；基因与蛋白表达采用q-PCR和免疫印迹分析；细胞周期与凋亡通过流式细胞术检测。统计方法包括Student's t检验和双因素方差分析（ANOVA）。

研究结果

1. T50RN细胞紫杉醇耐药特征

T50RN细胞对紫杉醇的耐药指数（RI）达53（IC₅₀为117.3 nM vs 亲本细胞2.2 nM）。紫杉醇处理24小时后，亲本细胞中多极纺锤体比例显著升高，而T50RN细胞需更高浓度才出现类似变化，证实其耐药性。

2. 长春西汀增强紫杉醇 cytotoxicity

长春西汀单用（≤40 μM）对细胞毒性轻微，但与紫杉醇联用后，T50RN细胞对紫杉醇敏感性显著提升（IC₅₀从100 nM降至18.1 nM），联合指数（CI）<1表明协同作用。此外，长春西汀加剧了紫杉醇诱导的纺锤体异常、有丝分裂阻滞和凋亡。

3. PDE1C高表达与耐药相关

T50RN细胞中PDE1C mRNA和蛋白表达显著上调。敲低PDE1C可部分恢复紫杉醇敏感性，但长春西汀在PDE1C缺失细胞中仍能增强紫杉醇毒性，提示其作用靶点不限于PDE1C。

4. 长春西汀促进微管稳定化

长春西汀单用短暂升高细胞内Ca²⁺和cAMP水平，并轻微增加微管聚合质量；与紫杉醇联用后，微管聚合程度和乙酰化微管水平显著增强。Ca²⁺螯合剂BAPTA-AM可逆转该效应，表明Ca²⁺信号参与微管稳定调控。

5. 线粒体功能与ROS作用

长春西汀处理6小时诱导线粒体超极化（TMRE荧光增强）和ROS生成，但超氧化物清除剂tiron未逆转其增敏效应，表明ROS非主要作用机制。

6. 抑制P-gp逆转耐药

T50RN细胞中ABCB1/P-gp表达显著升高，罗丹明123积累减少且外排增强。长春西汀或P-gp抑制剂Zosuquidar（Zo）均可抑制P-gp功能，增加细胞内药物滞留。Zo与长春西汀联用进一步协同增强紫杉醇 cytotoxicity。

讨论

长春西汀通过双重机制克服紫杉醇耐药：一是抑制P-gp介导的药物外排，提高细胞内紫杉醇浓度；二是通过抑制PDE1C增加cAMP和Ca²⁺水平，增强紫杉醇的微管稳定化作用。尽管长春西汀诱导线粒体ROS，但其主要效应与氧化应激无关。该研究为TNBC耐药治疗提供了联合用药新思路，但需进一步在动物模型和临床中验证。需注意长春西汀作为膳食补充剂的血药浓度较低（μM级），实际应用需考虑剂量与安全性。

结论

长春西汀通过靶向P-gp和PDE1C通路，显著增强紫杉醇在耐药TNBC细胞中的抗有丝分裂效应和细胞毒性，为克服紫杉醇耐药提供了潜在临床策略。