USP5上调介导的TRAIL耐药胶质瘤细胞抵抗睡茄果实提取物诱导的凋亡机制研究

　　本研究针对胶质瘤细胞对TRAIL（肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体）耐药性的临床难题，通过探究药用植物睡茄（Withania somnifera）果实提取物（FE）的作用机制，发现TRAIL耐药细胞（U87MG、LN229）经FE处理后通过上调去泛素化酶USP5促进生存，而敲低USP5可显著增强DR5受体和SMAC蛋白表达并激活凋亡。该研究揭示了USP5在胶质瘤治疗耐药中的关键作用，为联合靶向USP5的疗法提供了理论依据。

　　

胶质母细胞瘤作为最具侵袭性的脑肿瘤，患者中位生存期仅约一年，其复发和治疗耐药性仍是临床面临的重大挑战。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）因其特异性诱导肿瘤细胞凋亡且不损伤正常细胞的特性，曾被视为极具潜力的治疗策略，但多数胶质瘤细胞存在TRAIL耐药性，导致治疗效果受限。近年来，传统药用植物睡茄（Withania somnifera）因其抗肿瘤活性受到关注，但其果实提取物在TRAIL耐药胶质瘤中的作用机制尚不明确。

为探索睡茄果实提取物是否可克服TRAIL耐药性，研究人员开展了系统性实验。他们首先通过溶剂萃取法（氯仿-甲醇分级处理）制备睡茄果实提取物（W. somnifera FE），并采用高效液相色谱（HPLC）和高分辨率质谱（HRMS）分析其化学成分，鉴定出Withagenin A Diglucoside、Withaferin A等多种生物活性化合物。研究选用TRAIL敏感细胞T98G和TRAIL耐药细胞U87MG、LN229，通过MTT法检测细胞活力，发现W. somnifera FE单独处理仅在T98G中诱导凋亡，而在U87MG和LN229中无显著效果。

Annexin V-APC/PI染色进一步揭示：在T98G中，W. somnifera FE或TRAIL均可引起晚期凋亡，但二者联合反而抑制凋亡进展；而在U87MG和LN229中，所有处理均阻滞细胞于早期凋亡阶段，无法向晚期凋亡过渡。机制研究表明，TRAIL敏感细胞中USP5蛋白发生切割并下调，而耐药细胞中W. somnifera FE处理显著上调USP5表达。此外，SMAC（第二线粒体衍生的半胱天冬酶激活剂）在耐药细胞中经FE处理后表达升高，但凋亡仍被抑制，提示USP5可能通过调控SMAC稳定性促进生存。

关键实验技术包括：细胞培养与siRNA转染（靶向USP5敲低）、蛋白质免疫印迹（分析USP5、SMAC、LC3B、XIAP等蛋白表达）、半定量PCR（检测DR4/DR5受体mRNA）、流式细胞术（凋亡率定量）、免疫荧光（DR5定位与表达）、 caspase活性测定（颜色法检测caspase-2/9/3），以及基于cBioportal数据库的TCGA胶质瘤数据集分析（592例样本中USP5与EGFR表达相关性）。

USP5 knockdown enhances W. somnifera FE-induced apoptosis in TRAIL-resistant cells

通过siRNA敲低USP5后，TRAIL耐药细胞（U87MG和LN229）对W. somnifera FE的敏感性显著增强：流式细胞术显示晚期凋亡率大幅上升（U87MG中从3.04%增至50.85%，LN229中从1.05%增至58.37%），且caspase-9和caspase-3活性显著激活，证实线粒体途径凋亡被启动。同时，Western blot显示SMAC蛋白进一步上调，而自噬标记LC3B未激活，表明凋亡而非自噬是主要死亡方式。

W. somnifera FE upregulates DR5 expression upon USP5 depletion

免疫荧光和Western blot分析表明，USP5敲低联合W. somnifera FE处理可显著上调死亡受体DR5的表达，且去泛素化酶TNFAIP3的泛素化形式被抑制，提示USP5缺失通过稳定DR5和调节TNFAIP3促进凋亡信号传导。

Compositional analysis reveals cancer-promoting constituents in chloroform-unsolubilized fraction

HRMS鉴定显示，氯仿不溶级分中富含Withanamide J、Withaferin A等化合物，而氯仿可溶级分则具有更强的细胞毒性，表明溶剂处理策略直接影响提取物的生物活性构成，部分成分可能通过上调USP5介导促生存效应。

USP5 and EGFR are not mutually exclusive in glioma patients

基于TCGA数据库的分析发现，USP5在胶质瘤中突变率仅3%，而EGFR扩增率达47%，但两者无显著互斥性（p=0.13），且mRNA水平无相关性，表明USP5上调是独立于EGFR的耐药机制。

本研究结论表明，USP5作为去泛素化酶在TRAIL耐药胶质瘤中扮演关键角色：其表达上调可抑制W. somnifera FE诱导的凋亡，而靶向敲低USP5则通过增强DR5/SMAC信号通路恢复凋亡敏感性。这一发现不仅揭示了睡茄提取物在不同溶剂处理下可能具有双重作用（促凋亡或促生存），还为临床联合靶向USP5的疗法提供了理论依据，尤其对克服胶质瘤耐药性和防止复发具有重要意义。论文发表于《Scientific Reports》，为天然产物转化研究提供了机制深度与临床参考价值。