异质系大鼠视交叉上核中羟考酮暴露与戒断期间性别特异性转录特征及其对阿片使用障碍的持久影响

　　本研究针对阿片使用障碍（OUD）中睡眠与昼夜节律紊乱的核心问题，利用遗传多样性大鼠模型，探索了羟考酮自我给药不同阶段（中毒、戒断、 abstinence）对视交叉上核（SCN）转录组的性别特异性影响。研究发现，雌性和雄性大鼠在SCN中表现出截然不同的分子适应机制：雌性主要涉及神经传递、应激反应和能量代谢通路，而雄性则以免疫调节和氧化应激通路为主。这些持久且性别特异的转录特征揭示了SCN在OUD病理机制中的关键作用，为开发性别特异性治疗策略提供了新的分子靶点和理论依据。

　　

阿片使用障碍（Opioid Use Disorder, OUD）已成为全球性的公共卫生危机，仅在美国就有约760万人受其影响，几乎占全球病例的一半。这场危机可追溯至20世纪90年代，当时由于对疼痛管理的重视，阿片类药物处方量激增，尤其是羟考酮（oxycodone）这种强效且极易上瘾的止痛药。据统计，约有12%的处方阿片使用者面临发展为OUD的风险，而75%的OUD患者表示他们的滥用始于处方阿片。阿片类药物的滥用影响惊人，2017年，阿片类药物占所有药物相关死亡的一半以上。

在OUD的诸多症状中，睡眠和昼夜节律紊乱被公认为物质使用障碍的标志，这些紊乱通常在戒断期间出现并持续到戒断后。研究表明，60-70%的OUD患者符合昼夜节律相关疾病的诊断标准，常表现为睡眠质量差和激素节律紊乱，包括皮质酮和褪黑素周期的改变。慢性阿片使用会加剧这些紊乱，而昼夜节律失调可能增加渴求和负面情绪，从而提升复发风险。这些紊乱可能持续数月，甚至进入戒断期，导致OUD的高复发率。在无OUD的成年人中，急性阿片给药会减少第2阶段非快速眼动睡眠和快速眼动睡眠，而接受OUD治疗的个体常表现出长期改变的休息-活动节律，表明昼夜节律调节受损。实验室研究发现，OUD患者的死后脑组织表现出分子和突触蛋白质组节律的破坏，表明阿片暴露扰乱了内源性分子钟。在啮齿类动物模型中，药物寻求行为在昼夜周期中变化，并受到持续光照的影响，阿片诱导的昼夜节律紊乱可以通过褪黑素治疗部分缓解。此外，核心昼夜节律基因Neuronal PAS Domain Protein 2缺陷的雄性和雌性小鼠表现出阿片耐受和戒断症状的改变。这些发现表明，阿片暴露在转录、翻译和行为水平上扰乱人类和动物的昼夜节律。

然而，OUD中昼夜节律紊乱的分子机制仍知之甚少，尤其是在视交叉上核（suprachiasmatic nucleus, SCN）内。SCN是下丘脑的一个小区域，负责调节激素释放、睡眠-觉醒周期、新陈代谢和体温的日常节律。这些节律由内部生物钟产生，即使在没有外部线索的情况下也会持续。为了与外部光暗周期保持对齐，SCN需要每日重置，这是通过视网膜的直接光输入实现的。SCN内部计时的破坏可能对下游生理和行为功能产生广泛影响。尽管SCN功能障碍已被认为与物质使用障碍有关，但SCN在阿片暴露阶段（中毒、戒断和戒断）的转录组适应及其与成瘾表型的相关性仍不清楚。此外，阿片药效学、成瘾易感性和昼夜节律调节的性别差异表明SCN内存在性别特异的分子适应。因此，性别特异性分析对于揭示不同的SCN转录组特征至关重要，这些特征可能为靶向治疗策略提供信息。

在这项发表于《Addiction Neuroscience》的研究中，研究人员检查了雄性和雌性异质系（heterogeneous stock, HS）大鼠在四个关键阶段（初始状态、中毒、急性戒断和长期戒断）静脉羟考酮自我给药后SCN的转录组变化。与使用近交系啮齿类动物的其他研究相比，他们利用HS大鼠的遗传变异性更紧密地模拟了人类OUD中的基因组多样性。该研究被设计为一项探索性、假设生成的分析，主要目的是识别SCN中的候选基因、通路和性别特异性特征，这些可能 underlie OUD中的昼夜节律紊乱，为未来的机制工作提供框架。

为开展研究，团队采用了多项关键技术：使用遗传多样性HS大鼠模型模拟人类群体变异；通过静脉自我给药程序精确控制羟考酮暴露（剂量150 μg/kg/infusion）；在特定昼夜时间点（Zeitgeber Time, ZT）采集SCN组织；利用批量RNA测序（bulk RNA sequencing）获取转录组数据；通过差异表达分析（voom Limma包）和通路富集分析（Metascape）识别状态和性别特异的基因变化；应用节律基因分析（CircaDB数据库）评估基因表达的昼夜相位；采用加权基因共表达网络分析（WGCNA）构建基因模块并识别枢纽基因；并通过模块差异连通性（MDC）和行为相关性分析（PCA提取模块特征基因与行为指标关联） linking转录变化与成瘾表型。

3.1. Transcriptomic changes in female SCN during opioid exposure reveal acute disruptions and sustained stress responses

在雌性大鼠中，阿片暴露诱导了SCN广泛的转录组变化，特别是在中毒和戒断期间，持久的分子改变持续到戒断期。在所有比较中，共识别出3,030个差异表达（DE）转录本，其中上调基因（1,725）多于下调（1,305）。大多数DE转录本（2,799）是在与初始状态的比较中识别的（初始 vs. 中毒：1,074 DE转录本，上：377，下：697；初始 vs. 戒断：1,039 DE转录本，上：510，下：529）。通路富集分析显示，中毒期间，DE基因与神经传递和成瘾过程相关，包括囊泡介导的运输、突触信号（谷氨酸能突触、多巴胺能突触、催产素信号通路）、NMDA受体激活以及典型成瘾通路（可卡因、尼古丁、安非他明）以及昼夜节律驯化。戒断期间，富集通路包括炎症信号（白细胞介素-8产生的正调控）、应激反应（伴侣介导的蛋白质折叠）、细胞骨架重塑以及持续的神经递质信号和吗啡成瘾通路。在初始 vs. 戒断的比较中，DE转录本稍少（686 DE转录本：301上，385下），表明基因表达部分回归基线，但与细胞应激和器官修复（质膜修复）、突触信号（GABA能突触）、能量代谢（糖酵解、NADH代谢）和细胞骨架重塑相关的通路仍然改变。药物暴露状态之间的比较显示差异较少（中毒 vs. 戒断：123 DE；中毒 vs. 戒断：70 DE；戒断 vs. 戒断：38 DE），表明最显著的转录组转变发生在相对于初始状态。一个核心基因子集在多个暴露状态中表现出持续调控，表明SCN中持久的分子变化。涉及脂质代谢（Plin4, Slc27a6）和细胞应激反应（Hspb1, Cryab）的基因保持持续上调，表明能量稳态破坏和持续的应激信号。此外，几个DE基因显示出节律性表达谱。这些发现突出了雌性大鼠中时间调节的、状态依赖的节律基因表达，戒断相关的比较显示较晚的相位。总体而言，雌性大鼠中的阿片暴露引起SCN转录组变化，具有中毒和戒断期间的急性效应，以及持续到戒断期的应激、代谢和昼夜节律破坏。

3.2. Transcriptomic Changes in Males Reflect Acute Disruptions and Persistent Immune System Elevation

在雄性大鼠中，共识别出1,127个DE转录本，上调和下调转录本分布几乎相等（上：590，下：537）。大多数变化发生在中毒期间（初始 vs. 中毒：369 DE转录本，上：242，下：127），并富集在与DNA损伤应答和细胞周期调控（DNA损伤检查点信号）、神经传递和突触可塑性（AMPA受体运输、谷氨酸结合）、免疫调节（对II型干扰素的反应）和碳水化合物代谢（己糖跨膜运输）相关的通路中。变化持续到戒断期（初始 vs. 戒断：196 DE转录本，上：137，下：59；中毒 vs. 戒断：325 DE转录本，上：96，下：229），富集通路涉及免疫反应和炎症（B细胞活化、T细胞分化）、脂质代谢（胆固醇生物合成、囊泡介导运输）和细胞信号（NF-kappaB信号、细胞对生物刺激的反应）。这些发现表明戒断期以代谢、细胞应激和突触信号的持续破坏为特征，反映了持续的适应而非回归基线。戒断期观察到的变化稍少（中毒 vs. 戒断：107 DE转录本，上：41，下：66；戒断 vs. 戒断：57 DE转录本，上：29，下：28；初始 vs. 戒断：73 DE转录本，上：45，下：28），表明部分回归基线，但与细胞解毒和应激反应（细胞氧化剂解毒、细胞解毒、细胞对有毒物质的反应、解毒）以及脂质代谢和膜动力学（甘油磷脂生物合成、甘油磷脂生物合成过程）相关的通路仍然升高。大多数转录组变化在中毒和戒断期最为明显，戒断期有回归基线的趋势，但免疫相关通路仍然升高，表明持久效应。一个基因子集在所有药物暴露状态（中毒、戒断和戒断）中差异表达，表明慢性羟考酮暴露后SCN中持续的转录改变。这些基因与细胞内信号（Pld2, Etnk2）、蛋白质调控（Tceanc2, Nrbp2）和免疫反应（Mx2）相关。值得注意的是，编码果糖转运蛋白GLUT5的Slc2a5基因在所有阶段都失调，指出SCN中代谢感知的改变。这些持久变化突出了SCN功能的稳定转变，可能导致雄性中阿片使用的长期生理后果。一个DE基因子集也表现出节律性表达模式。总体而言，雄性大鼠中的慢性阿片暴露导致SCN中持续的转录组变化，具有中毒和戒断期间的急性破坏，以及免疫反应、代谢的持久改变。

3.3. Distinct sex-specific transcripts emerged during abstinence, potentially regulated by rhythmic genes

在所有组中，共有337个DE转录本受到性别影响，下调（214）多于上调（123）。在所有药物状态中观察到性别差异：初始状态115个（上：50，下：65），中毒59个（上：17，下：42），戒断70个（上：32，下：38），戒断93个（上：24，下：69）。尽管受性别影响的DE基因数量在各组中相似，但具体的DE转录本集合是不同的。只有三个转录本在所有状态中共享，配对之间的重叠最小。在初始状态，性别差异富集于RNA加工和剪接（RNA剪接的调控）和分子运输（过渡金属离子运输）。中毒期间，富集通路涉及细胞结构、运动和运输（细胞外运输、微管基运输）、细胞死亡和存活通路（内在凋亡信号通路的调控）以及代谢调控（对营养物质的反应）。戒断期间，富集通路聚焦于炎症和免疫调节（白细胞介素-6产生的正调控、肿瘤坏死因子产生的正调控）、凋亡和细胞死亡通路（凋亡信号通路）以及细胞代谢和应激反应（细胞对营养的反应、细胞应激反应的调控）。戒断期间，富集通路包括细胞对应激的反应、对缺氧的反应、对氧含量降低的反应以及线粒体功能（线粒体基因表达、线粒体膜组织）。DE转录本的最小重叠和不同的富集通路表明，性别在不同药物状态中以不同方式调节SCN功能，导致整个成瘾过程中不同的分子反应。为了进一步探索这些差异，应用了RRHO，一种无阈值方法比较性别特异性基因表达模式。在中毒期间（初始 vs. 中毒）和向戒断的过渡中（中毒 vs. 戒断）发现了性别之间的广泛重叠，而从戒断向戒断的转变中出现了显著的不一致，表明性别特异性转录模式在戒断期变得更加明显。一个性别特异性DE基因子集表现出节律性表达谱。戒断期节律性DE基因的比例显著高于初始和戒断阶段，表明这些节律基因可能是戒断期观察到的性别差异的关键驱动因素。

3.4. Co-expression network analysis reveals distinct hub genes associated with intoxication

在所有受试者中进行的加权基因共表达网络分析（WGCNA）识别出13个共表达基因模块。模块特征基因-性状分析揭示了几个显著关联（p<0.05）。与中毒状态相关的多个模块中，每个都有不同的枢纽基因特征和富集的生物学通路。例如，黑色模块富集了涉及突触功能、神经元信号和细胞内运输的基因，包含如Vsnl1、Rbfox3、Syt7、Ache和Rapgefl1等枢纽基因，这些基因涉及钙信号、突触囊泡循环和神经递质调控。通路富集分析显示显著参与突触中的囊泡介导运输、突触囊泡周期以及神经递质特异性信号通路，包括多巴胺、血清素、谷氨酸和阿片信号。此外，与昼夜节律驯化、长时程增强和催产素信号相关的通路表明神经可塑性的更广泛改变。有趣的是，心脏相关通路（心脏传导、心肌细胞钙调控）的富集指出了阿片暴露的潜在外周或自主神经效应。红色模块包含与纤毛和微管基结构相关的基因，如Cfap52、Spag8、Tekt1和Enkur，富集了涉及纤毛或鞭毛依赖的运动、马达蛋白活性、肌节组织和骨骼肌收缩的通路。这表明细胞骨架重塑和细胞内运输的作用。此外，与心脏发育和左右不对称确定相关的发育通路被富集，突出了中毒在激活与细胞结构相关的基因中的作用。黄色模块主要由如Tubb2a、Rtn1、Rnf208和Myo6等基因组成，表明中毒期间翻译和细胞活性升高。富集通路包括对氧化应激的反应、多细胞生物应激、轴突损伤和突触信号。为了总结每个WGCNA模块内的基因表达，对所有模块分配基因的标准化表达值进行了主成分分析（PCA）。提取了第一个主成分（PC1），捕获每个模块内的主导变异，并将其与行为测量相关联。通过总结每个药物组中每个模块的PC1，识别出了SCN基因共表达与成瘾相关行为之间独特的、组特异性关联。在戒断组，更严重的成瘾表型与黑色模块基因的较高表达相关，这些基因涉及突触信号和神经递质调控。在中毒组，更严重的成瘾表型与红色模块基因的较低表达相关，这些基因涉及纤毛和微管功能。这些SCN中的转录特征可能 underlie 阿片暴露后的持久变化，并与行为脆弱性相关。随后使用模块差异连通性（MDC）比率评估了性别差异，该比率量化了药物状态之间模块内连通性的变化。在雌性中，黑色和红色模块在戒断、中毒和戒断期间表现出增加的连通性。蓝色和黄色模块在戒断和戒断状态中显示出增加的连通性。 turquoise模块仅在戒断状态显示出增加的连通性。在雄性中，蓝色模块在戒断和戒断状态中显示出降低的连通性。黄色模块在所有药物状态中表现出增加的连通性。洋红色和红色模块在戒断期间显示出连通性的显著增加。 turquoise模块仅在戒断状态显示出增加的连通性。

研究结论与讨论部分强调，本研究提供了关于阿片暴露期间SCN中性别特异性转录组改变及其与异质系（HS）大鼠成瘾样行为关系的新见解。通过检查羟考酮自我给药对四个关键阶段（初始、中毒、戒断和戒断）SCN基因表达的影响，识别了显著的性别差异，这些差异在戒断期尤为明显。研究结果揭示了雌性和雄性大鼠对阿片暴露的截然不同的分子反应：雌性主要涉及神经传递、突触功能、昼夜节律和炎症通路的改变，并伴随着持久的细胞应激相关转录特征；而雄性则主要涉及免疫调控、DNA损伤和代谢的改变，并在戒断期持续表现出免疫系统激活和细胞解毒通路。这些性别差异反映了先前关于雄性和雌性对阿片反应不同的报告，并提出了可测试的假设：例如，雌性中的应激相关通路可能 contribute to 早期戒断脆弱性，而雄性中的免疫相关通路可能反映了SCN中持久的神经炎症过程，可能影响复发脆弱性。RRHO分析强化了这种分歧，揭示了在早期药物状态（中毒和戒断）中性别间更多的重叠，但在戒断期显著的不一致。值得注意的是，两性都显示出性别特异性节律DE基因的变化，戒断期显示出比中毒和戒断期更高比例的节律性、性别依赖性DE基因，这些基因的峰值相位在戒断期较早发生。共表达网络分析揭示了与不同药物状态相关的 distinct 基因模块，其中黑色和红色模块分别显示与中毒的正和负关联。行为相关性分析表明，SCN基因共表达与成瘾相关行为之间存在状态特异性关联， linking 转录变化与行为表型。这些发现 underscore SCN作为OUD病理机制中的关键脑区，并强调了在OUD治疗中考虑性别差异的重要性。作为一项探索性研究，这些结果为后续研究确定了候选基因、通路和网络，以验证它们在阿片相关行为中的因果作用。未来的研究应调查SCN中这些分子改变如何与成瘾中涉及的其他脑区相互作用，以及靶向昼夜节律通路是否可以为治疗OUD提供新方法。