整合多组学技术揭示柔肝颗粒通过调控肝星状细胞机械激活与肝窦内皮细胞脂代谢改善肝硬化的机制

　　本研究针对肝硬化进展导致严重并发症的临床难题，探索了临床应用二十余年的中药复方柔肝颗粒(Rgkl)的治疗机制。研究人员通过整合网络药理学、转录组学和单细胞测序技术，发现Rgkl通过调控CD36/PPAR/CPT-1通路改善肝窦内皮细胞(LSEC)脂代谢，通过RhoA/ROCK/YAP和PI3K/AKT/NF-κB通路抑制肝星状细胞(HSC)活化，并鉴定出Levistilide A、Quercetin等18种活性成分。该研究为肝硬化治疗提供了多靶点治疗策略，发表于《Chinese Medicine》2025年第20卷。

　　

肝硬化作为各种慢性肝病的终末病理阶段，每年导致全球约116万人死亡，其中中国患者占死亡负担的11%。最突出的并发症门静脉高压(PH)主要由持续升高的肝内血管阻力(IHVR)驱动，这种病理改变源于广泛的肝细胞坏死、弥漫性结节再生和纤维间隔形成，共同促进假小叶形成。这些结构紊乱导致肝架构崩溃和肝血管结构显著扭曲，严重阻碍门静脉回流。更重要的是，除了大量实质坏死外，非实质细胞——特别是肝窦内皮细胞(LSEC)和肝星状细胞(HSC)——在升高IHVR中起决定性作用。

在病理条件下，LSEC去窗孔化和基底膜形成严重损害肝血液供应和代谢交换。此外，LSEC分泌血管内皮生长因子(VEGF)促进病理性血管生成，加剧肝血管网络紊乱。值得注意的是，LSEC衍生的内皮素-1(ET-1)诱导异常HSC收缩，机械扭曲血管壁并增加肝内血流动力学阻力。同时，活化的HSC通过过度细胞外基质(ECM)沉积加剧IHVR，提高组织硬度并压迫肝窦。最新研究强调了HSC收缩和机械转导通路在肝硬化进展中的关键作用。

新兴证据表明，机械和生化线索都能激活HSC中的RhoA/ROCK信号级联，驱动应激纤维组装和持续细胞收缩性。同时，纤维化肝组织中的机械敏感YAP/TAZ信号促进COL1A1分泌，建立了一个自我强化的"COL1A1-组织硬度-YAP"肿瘤促进微环境。此外，升高的IHVR直接破坏LSEC鞘脂代谢，上调致癌介质鞘氨醇-1-磷酸(S1P)。这些发现共同强调LSEC和HSC通过多层面机制协同驱动肝硬化，强调需要多靶点治疗策略而非单细胞或单通路干预。

柔肝颗粒(Rgkl)基于经典方剂血府逐瘀汤的治疗原则开发，特别受到其代表性药对当归(DG)和白芍(CS)的启发，以其活血化瘀特性而闻名。为增强疗效，Rgkl还加入了三七(SQ)、泽兰(ZL)、女贞子(NZZ)、牛膝(NX)、黄芪(HQ)等中药材。在中医临床中，Rgkl已用于治疗肝硬化及其并发症超过二十年。

为阐明Rgkl改善肝硬化的分子机制，研究人员开展了一项综合研究，主要运用了以下关键技术方法：通过CCl₄诱导建立肝硬化小鼠模型；采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS/MS)鉴定Rgkl血中成分；运用网络药理学分析预测活性成分和作用靶点；通过转录组测序分析基因表达变化；采用单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术鉴定细胞特异性作用机制；使用蛋白质免疫印迹(WB)和免疫荧光验证关键蛋白表达；通过分子对接模拟活性成分与靶蛋白的结合作用。实验动物来自北京维通利华实验动物技术有限公司，细胞系LX-2人肝星状细胞购自上海中乔新舟生物科技有限公司。

效果评价：Rgkl对肝硬化小鼠影像学和病理组织学的影响

通过影像学分析发现，在肝纤维化第6周阶段，模型组肝脏硬度值显著增加，肝内血流速度显著降低。到第10周，肝脏硬度值达到对照组的近两倍，肝血流速度降低30%以上。Rgkl低高剂量治疗能显著降低肝纤维化阶段的肝脏硬度值，并在肝硬化阶段显示显著益处。高剂量Rgkl对肝硬化小鼠肝内血流速度有良好改善效果，甚至接近对照组水平，这是扶正化瘀胶囊所不具备的优势。

肝组织病理学分析显示，对照组肝索排列整齐，肝小叶完整，间质胶原沉积少，无肝细胞变性坏死。模型组肝索结构紊乱，肝小叶破坏，可见炎性细胞浸润和病理性血管异常增生。Masson染色显示模型组肝组织大量胶原沉积，将肝细胞分割成团块状，形成明显假小叶结构。定量评估证实模型组胶原表达比对照组上调七倍。虽然Rgkl高剂量组仍有炎性细胞浸润，但胶原沉积显著减少。

作为HSC活化的标志性生物标志物，α-SMA在模型组中表现出显著上调，而Rgkl和扶正化瘀胶囊能差异性地抑制其表达。血清生化分析显示，模型组小鼠ALT和AST水平显著升高，但都能被Rgkl显著逆转。肝纤维化生物标志物分析显示，肝硬化小鼠血清HA水平比正常对照组升高三倍。Rgkl低高剂量都能显著减弱HA过度产生，显示出相当的治疗效果。

机制探索：Rgkl对肝硬化小鼠肝血管病变的影响

微血管密度(MVD)作为微血管数量的指标，CD34常用于评估微血管数量变化。免疫组化分析显示正常肝组织中CD34表达稀少，而肝硬化模型显示显著增生。Rgkl剂量依赖性地减弱CD34阳性内皮扩张，高剂量效果与阳性对照扶正化瘀胶囊相当。这些发现与Rgkl先前证明的改善肝微循环血流动力学一致。

作为特化毛细血管，肝窦窗孔数量在物质交换中起关键作用。扫描电镜观察发现，模型组肝窦窗孔数量显著减少，而Rgkl高剂量治疗后显著增加。机制上，血管介质eNOS和VEGF在维持窦状隙窗孔中至关重要。模型组显示eNOS活性抑制同时VEGF表达上调两倍。Rgkl低高剂量都能增加eNOS水平，并对VEGF过度表达产生强效抑制，高剂量效果甚至超过扶正化瘀胶囊。

成分鉴定：Rgkl治疗肝硬化的药效成分预测

初步阶段，研究人员使用UPLC-Q-TOF-MS/MS从Rgkl中鉴定出182种原型化合物。随后对其血吸收成分分析得到正负离子模式下的总离子色谱图。经过去重和空白血清成分扣除后，筛选出72种血吸收成分，包括单萜苷、生物碱、酚酸、皂苷和黄酮类化合物。为验证准确性，选择了代表性药物成分进行分析。粉防己碱(来自粉防己)、藁本内酯A(来自川芎)、科罗索酸(来自泽兰)、人参皂苷Rk3(来自三七)和芍药苷(来自芍药)与它们标准的保留时间偏差在0.1分钟内，证实了分析精度。

进一步的网络药理学研究从TCMSP和Swiss Target Prediction数据库收集了Rgkl血吸收成分对应的759个靶点。继续与5,807个肝硬化相关靶点取交集，鉴定出493个重叠靶点。随后构建了药物成分与疾病靶点相互关系的网络图，按度值优先排序排名靠前的候选生物活性成分。值得注意的是，君药DG和CS的潜在活性成分约占优先候选的50%，包括藁本内酯、阿魏酸、芍药苷、藁本内酯A和粉防己碱，表明它们在Rgkl改善肝硬化中的关键作用。

靶点预测：网络药理学鉴定Rgkl治疗肝硬化的关键靶点

对493个药物-靶点的PPI网络分析确定了102个核心靶点，随后通过蛋白质聚类分析分为三个功能簇。簇1以PPARG为中心，与脂质代谢、细胞迁移、细胞增殖和血管生成相关。簇2基于IL6蛋白，调节炎症、免疫反应和代谢稳态。簇3聚焦于CTSB蛋白，与免疫防御过程相关。

对102个核心靶点的GO和KEGG富集分析基于FDR确定了294个GO条目。其中193个与生物过程相关的涉及信号转导、血管生成调节和蛋白质磷酸化；38个与细胞成分相关的涉及粘着斑、细胞外区和线粒体；其余63个与分子功能相关，包括蛋白质结合、整合素结合和蛋白质丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性等。KEGG通路分析证明了Rgkl的多通路调节能力，包括20条信号通路，如PI3K-Akt信号、脂肪酸降解、PPAR信号和ECM-受体相互作用等。成分-核心基因-通路网络进一步突出了DG和CS等草药的主要治疗贡献。

转录组学：Rgkl对肝硬化小鼠肝组织基因表达的影响

为阐明肝硬化进展过程中的转录组变化以及Rgkl对门静脉高压作用机制，对对照组(Con)、模型组(Mod)和Rgkl高剂量组(Rh)肝组织总RNA进行了转录组分析。PCA图显示组间显著转录差异，模型组沿主成分向右移动，而Rh组与对照组相似。

差异表达基因(DEGs)分析鉴定出Con vs Mod比较中有1,528个DEGs，其中857个上调和671个下调；而Rh vs Mod比较中有760个DEGs，其中409个上调和351个下调。同时，热图显示每组间DEGs存在显著差异。将Con vs Mod和Rh vs Mod DEGs的交集(共529个基因)作为探索Rgkl在肝硬化治疗中作用的目标基因。对上述交集进行GO、KEGG分析，重点关注富集度最高的20条信号通路。发现Rgkl主要通过影响PI3K-Akt信号通路、脂肪酸降解、PPAR信号通路和血管平滑肌收缩等信号通路来治疗肝硬化。

将上述获得的Top20通路进一步与网络药理学富集的通路取交集，共获得9条通路：PI3K-AKT信号、FoxO信号、mTOR信号、ECM-受体相互作用、粘着斑、血管平滑肌收缩、脂肪酸降解、PPAR信号和TRP通道的炎症介质调节。使用KEGG通路映射，我们起草了一个描述Rgkl抗肝硬化作用机制的网状图，连接了上述九条信号通路的上游-下游关系。该网络在功能上分为三个核心模块：脂质代谢、机械力学和炎症激活，与先前网络药理学分析中确定的三个蛋白质簇一致。

具体来说，由CD36/PPAR/CPT-1介导的鞘脂代谢和脂质代谢信号通路与代谢调节效应相关；由于ECM/粘着斑激酶(FAK)引起的RhoA/ROCK和YAP信号通路与细胞内机械力学调节相关；炎症激活富集到更经典的PI3K/AKT/NF-κB信号通路。

单细胞测序：研究Rgkl治疗肝硬化的主要靶细胞

如前所述，LSEC和HSC被认为是驱动肝硬化进展的关键效应细胞。虽然转录组分析准确识别了Rgkl调节的核心信号通路，但其对LSEC和HSC的具体影响需要进一步阐明。因此，采用单细胞测序技术系统区分肝细胞群体，鉴定出10种不同细胞类型，包括LSEC和HSC。通过Rh vs Mod差异表达基因的KEGG通路分析，我们继续分析Rgkl对这两种细胞的影响。令人惊讶的是，启动鞘脂和脂质代谢的PPAR信号通路和脂肪酸降解主要富集在LSEC中(在HSC中富集排名较低)。此外，与机械力学激活相关的粘着斑、ECM-受体相互作用和炎症通路PI3K-Akt信号通路也在HSC中富集。这些发现表明Rgkl通过协调靶向LSEC和HSC功能在肝硬化治疗中发挥双重治疗效果。

功能验证：Rgkl调节HSC和LSEC功能治疗肝硬化的验证实验

为验证单细胞测序结果，通过WB评估了肝硬化小鼠原代HSC和LSEC核心通路内关键靶点的变化。在HSC中，关键靶点ROCK(ECM-受体相互作用和粘着斑的关键介质)的表达在肝硬化模型中增加，可被Rgkl治疗剂量依赖性地抑制。类似地，ROCK下游的机械敏感因子YAP在肝硬化HSC中表现出明显的去磷酸化。Rgkl低高剂量都能逆转这一现象，但阳性对照药物扶正化瘀胶囊的效果更优。

基本上，为筛选靶向ROCK的药理活性成分，采用分子对接发现Paeonilactone C、Quercetin、Levistilide A和Luteolin与ROCK具有高结合能。接下来选择Levistilide A作为代表进行验证。免疫荧光显示，在NC和ROCK敲低HSC中，YAP核定位无显著变化，但在ROCK-OE HSC中显示核转位显著抑制，证实其作为Rgkl改善肝硬化门静脉高压的机械激活成分的作用。同时分析表明Rgkl低高剂量能抑制HSC中的炎症激活。

在原代LSEC中，参与脂质氧化catabolism的PPARα/CPT-1A在肝硬化小鼠中下调，能被Rgkl低高剂量差异性地逆转。对PPARα进行的分子 docking鉴定出Rgkl的药效成分如Quercetin和Kaempferol可能是通过调节LSEC脂质代谢改善肝硬化的关键。因此，我们得出结论：Rgkl可能从脂质代谢、机械和炎症激活三个方面以及HSC和LSEC两种细胞改善肝硬化。

研究结论与意义

本研究建立了生物信息学虚拟预测与转录组分析和单细胞测序验证的协同框架，阐明了Rgkl治疗肝硬化的分子机制。同时，系统地将核心通路映射到特定肝细胞群体(涉及机械力学、炎症和脂质代谢多个维度)。在此基础上，本研究确定了Levistilide A和Quercetin等成分通过干预HSC收缩和LSEC脂质代谢治疗肝硬化的潜力。

该研究的重要意义在于：首先，揭示了中药复方多成分、多靶点、多通路协同作用的科学内涵，为中药现代化研究提供了范例；其次，发现了机械力学因素在慢性肝病中的主导作用，为肝硬化治疗提供了新视角；第三，鉴定出的活性成分如Levistilide A、Quercetin等为后续药物研发提供了先导化合物；最后，研究结果为临床治疗肝硬化提供了理论依据和治疗策略，具有重要的临床转化价值。

尽管该研究取得了重要进展，但仍存在一些局限性，如鉴定的通路是否普遍适用于不同病因的肝病，以及对中药研究的五个成分(生物合成成分、原始成分、转化成分、原型成分和效应成分)的综合评价是否充分，值得进一步研究。