METTL3/m6A/miR-34a-5p轴通过Wnt/β-catenin通路抑制三叉神经血管系统激活缓解偏头痛

　　本刊推荐：为解决偏头痛治疗靶点不足的问题，张辉团队开展METTL3介导m6A甲基化调控神经炎症的机制研究。发现METTL3通过m6A修饰促进pri-miR-34a加工为miR-34a-5p，后者靶向抑制Wnt1/β-catenin通路，加剧三叉神经血管系统（TGVS）激活。该研究揭示RNA表观遗传调控偏头痛的新机制，为靶向METTL3/miR-34a-5p轴治疗偏头痛提供理论依据。

　　

偏头痛作为一种常见的神经血管性疾病，全球患病率高达15%，其特征表现为反复发作的中重度搏动性头痛，常伴随光敏感、声音过敏和恶心等症状。尽管当前针对偏头痛的特定治疗药物如曲坦类（5-HT_1B/1D受体激动剂）、gepants（小分子降钙素基因相关肽(CGRP)受体拮抗剂）和CGRP单克隆抗体取得了显著进展，但仍存在明显局限性：约30-40%患者对曲坦类药物反应不足，而新型CGRP靶向治疗的长期安全性尤其是心血管和肝脏效应仍需进一步评估。这些治疗挑战加之涉及神经源性炎症、皮质扩散性抑制和神经元敏化的复杂病理生理机制，凸显了发现新治疗靶点的迫切性。

近年来研究表明，神经炎症反应以及三叉神经血管系统（trigeminovascular system, TGVS）的激活和敏化在偏头痛发生发展中起关键作用。TGVS激活导致神经肽（如CGRP和P物质）释放，触发血管扩张、神经炎症和疼痛信号传递，从而诱发偏头痛发作。因此，抑制TGVS激活成为缓解偏头痛的重要策略。同时，甲基转移酶样3（METTL3）介导的N6-甲基腺苷（m⁶A）甲基化作为神经炎症反应中的关键表观遗传调控机制日益受到关注。METTL3通过调节mRNA稳定性和翻译过程影响神经元功能，其介导的m⁶A修饰异常与突触可塑性改变、神经元兴奋性异常和神经炎症密切相关，而这些过程均与偏头痛机制相关。

MicroRNA（miRNA）作为一类长约22个核苷酸的内源性非编码单链RNA，在偏头痛发病机制中发挥重要调控作用。前期研究表明miR-34a-5p在偏头痛大鼠模型中表达升高且与CGRP水平正相关，体外实验也支持miR-34a-5p作为偏头痛干预的潜在靶点。值得注意的是，m⁶A修饰可通过影响miRNA成熟过程调控靶基因表达：METTL3催化的m⁶A甲基化能够增强DGCR8（DiGeorge综合征关键区域基因8）对特定pri-miRNA的亲和力，从而促进其加工成熟为功能性miRNA。通过TargetScan数据库预测发现miR-34a-5p与Wnt1的3'UTR区域存在潜在结合位点，而Wnt/β-catenin信号通路在偏头痛发病中的作用初现端倪——研究表明Wnt信号通路的强效抑制剂dickkopf相关蛋白1（DKK1）水平升高与偏头痛发病存在显著因果关系。

在此背景下，张辉等研究人员在《The Journal of Headache and Pain》发表了题为"Inhibition of the METTL3/m6A/miR-34a-5p axis suppresses trigeminovascular activation in nitroglycerin-induced migraine via the Wnt/β-catenin pathway"的研究论文，系统探讨了METTL3是否通过m⁶A甲基化pri-miR-34a促进miR-34a-5p表达，并通过靶向Wnt1抑制Wnt/β-catenin信号通路，从而增强TGVS激活并参与偏头痛发病机制。

本研究采用慢性间歇性硝酸甘油（NTG）注射制备大鼠偏头痛模型，通过行为学测试评估偏头痛样症状，使用蛋白质印迹、qPCR、ELISA和免疫荧光等技术分析METTL3、miR-34a-5p及下游靶点的蛋白和RNA水平，并通过Co-IP、RIP和荧光素酶报告实验验证METTL3、miR-34a-5p和Wnt1之间的相互作用。研究使用雄性Sprague-Dawley大鼠避免动情周期激素波动对疼痛感知的影响，通过侧脑室注射腺病毒载体实现METTL3敲低，采用von Frey纤维丝和热板试验分别检测机械性异常性疼痛和热痛觉过敏，并利用原代三叉神经元细胞进行体外机制验证。

METTL3在偏头痛大鼠中表达上调

研究发现，与盐水对照组相比，NTG给药后大鼠机械阈值和热痛反应潜伏期逐渐降低，表明偏头痛模型成功建立。Western blot和免疫荧光分析显示，NTG激发大鼠的三叉神经节（TG）中METTL3蛋白表达显著上调，提示METTL3可能参与偏头痛疾病进程。

敲低METTL3减轻TGVS激活并缓解偏头痛症状

通过侧脑室注射Ad-sh-METTL3实现METTL3敲低后，NTG引起的机械阈值和热痛潜伏期降低得到逆转。NTG大鼠血清中一氧化氮（NO）、CGRP和垂体腺苷酸环化酶激活肽（PACAP）水平显著升高，而沉默METTL3部分逆转了这些变化（NO降低32.74%，CGRP降低34.62%，PACAP降低50.06%）。NTG组TG中COX2、CGRP、PACAP和METTL3水平升高，METTL3沉默减轻了这种升高（COX2降低29.78%，CGRP降低28.71%，PACAP降低24.31%）。此外，NTG触发大鼠TG中c-Fos表达升高，而METTL3敲低使其水平降低62.48%。这些结果表明METTL3敲低可减弱TGVS激活并缓解偏头痛症状。

METTL3通过介导m⁶A修饰上调miR-34a-5p

研究发现METTL3敲低显著抑制了NTG处理大鼠TG中pri-miR-34a下调和miR-34a-5p上调。过表达METTL3证实其与DGCR8相互作用，且METTL3添加明显下调pri-miR-34a并上调miR-34a-5p。RIP assay表明METTL3添加增强了DGCR8与pri-miR-34a的结合，且METTL3过表达促进了pri-miR-34a的m⁶A修饰。这些结果说明METTL3通过m⁶A修饰促进DGCR8对pri-miR-34a的识别，从而促进其加工成熟为miR-34a-5p。

METTL3通过miR-34a-5p调控TGVS相关分子水平

抑制miR-34a-5p可部分缓解METTL3添加引起的大鼠TG神经元中NO、CGRP和PACAP产生增加。METTL3显著上调COX2、CGRP、PACAP和c-Fos蛋白水平，而抑制miR-34a-5p导致这些蛋白部分下调。这些发现阐明METTL3通过上调miR-34a-5p促进TGVS激活。

METTL3通过miR-34a-5p抑制Wnt1/β-catenin通路

NTG处理大鼠TG中Wnt1和β-catenin表达显著下调，而敲低METTL3部分抵消了NTG诱导的效应。METTL3添加显著降低三叉神经元细胞中Wnt1和β-catenin蛋白水平，而沉默miR-34a-5p可恢复Wnt1和β-catenin表达。这些结果表明METTL3通过miR-34a-5p抑制Wnt1/β-catenin轴激活。

miR-34a-5p抑制Wnt1/β-catenin通路激活

通过TargetScan预测发现miR-34a-5p与Wnt1存在结合位点。荧光素酶实验证实miR-34a-5p添加显著降低Wnt1-WT的荧光素酶活性，而对Wnt1-MUT无影响。miR-34a-5p过表达降低Wnt1 mRNA水平，且miR-34a-5p添加导致Wnt1和β-catenin蛋白水平大幅下降，而Wnt1过表达抵消了miR-34a-5p对这些蛋白表达的影响。总之，METTL3可通过上调miR-34a-5p抑制Wnt1/β-catenin轴激活。

miR-34a-5p通过Wnt1/β-catenin通路调控TGVS相关分子水平

miR-34a-5p添加显著提高NO、CGRP和PACAP水平，而Wnt1添加消除了miR-34a-5p的影响。Wnt1过表达抵消了miR-34a-5p对COX2、CGRP、PACAP和c-Fos蛋白水平的上调作用。总体而言，miR-34a-5p可能通过Wnt1/β-catenin轴调控TGVS激活。

miR-34a-5p通过调控Wnt1/β-catenin通路加剧偏头痛

NTG注射后大鼠机械阈值和热痛潜伏期逐渐下降，而抑制miR-34a-5p可部分逆转此效应。miR-34a-5p敲低显著降低NTG处理大鼠血清中升高的NO、CGRP和PACAP水平。miR-34a-5p在NTG处理大鼠TG中显著上调，且miR-34a-5p沉默逆转了这种上调。miR-34a-5p抑制显著抑制NTG诱导的COX2、CGRP和PACAP表达，同时恢复NTG抑制的Wnt1和β-catenin水平。此外，抑制miR-34a-5p导致NTG处理大鼠TG中c-Fos水平显著降低。这些发现表明抑制miR-34a-5p可激活Wnt1/β-catenin通路并减轻TGVS介导的偏头痛症状。

本研究阐明了偏头痛发病中的一个新颖表观遗传调控级联：METTL3介导的m⁶A修饰促进DGCR8依赖性pri-miR-34a加工成熟为miR-34a-5p，后者通过靶向抑制Wnt1/β-catenin信号通路加剧TGVS激活。这一机制轴不仅将RNA表观转录组学与神经血管失调联系起来，而且将METTL3和miR-34a-5p定位为减轻偏头痛相关伤害性敏化的潜在治疗靶点。

研究的创新性在于首次揭示METTL3/m⁶A/miR-34a-5p/Wnt1-β-catenin信号轴在偏头痛发病中的关键作用，为偏头痛的表观遗传调控机制提供了新见解。从转化医学角度，靶向这一通路可能为偏头痛治疗开辟新途径：针对METTL3的小分子抑制剂或miR-34a-5p拮抗剂可能成为新型偏头痛治疗策略。此外，检测外周血中METTL3或miR-34a-5p水平可能为偏头痛提供新的生物标志物。

研究也存在一定局限性：仅使用雄性大鼠避免激素变异性，而雌激素已知可调节CGRP等偏头痛相关介质表达，鉴于偏头痛在女性中患病率和严重度更高，需在雌性模型中探索METTL3作用并评估潜在性别特异性调控机制；METTL3可能通过替代机制产生额外效应，如与转录调节因子或RNA结合蛋白相互作用独立于m⁶A修饰调节基因表达，未来研究需使用METTL3催化突变体、RIP-seq或全转录组m⁶A谱分析区分METTL3在偏头痛中的m⁶A依赖性和非依赖性功能；目前尚无临床数据显示人类偏头痛患者血液或三叉系统中METTL3或miR-34a-5p水平变化，未来研究需检测偏头痛患者尤其急性发作期血液或脑脊液中METTL3和miR-34a-5p表达。

总之，该研究揭示了METTL3通过m⁶A依赖性上调miR-34a-5p促进偏头痛发病的新机制，为偏头痛的精准治疗提供了潜在新靶点，对深入理解RNA表观遗传修饰在神经系统疾病中的作用具有重要意义。