肥大细胞增多症中具有表观遗传改变的基因的下一代测序

《Clinical and Translational Allergy》：Next Generation Sequencing of Genes With Epigenetic Alterations in Mastocytosis

　　系统性肥大细胞增多症（SM）的致病机制涉及KIT p.D816V突变及表观遗传调控，本研究通过NGS分析32例ISM患者和16名对照组的候选基因，发现TET2、DNMT3A、SETD2和BRD4存在显著变异，其中两个为新变种，支持表观遗传在ISM中的作用。

　　本研究聚焦于系统性肥大细胞增多症（Systemic Mastocytosis, SM）的遗传与表观遗传机制，旨在进一步揭示其发病和进展中的关键基因变化。肥大细胞增多症是一种罕见的血液系统疾病，其特征是肥大细胞在体内器官（包括骨髓）中的异常增殖和积累。该疾病通常与一种特定的致癌性基因突变——KIT p.D816V密切相关，该突变在超过80%的SM患者中被检测到，并且在90%以上的惰性系统性肥大细胞增多症（Indolent Systemic Mastocytosis, ISM）患者中存在。尽管KIT突变是该疾病的主要驱动因素，但其在不同临床亚型中的作用仍需更深入的探讨。此外，遗传学和表观遗传学的相互作用在疾病的复杂性中扮演着重要角色，这为理解其病理机制和寻找新的治疗靶点提供了重要线索。

在研究中，科学家们基于之前对表观遗传学的探索，选取了110个候选基因进行全基因组测序（Next Generation Sequencing, NGS），以识别与SM相关的体细胞突变。研究对象包括32名ISM患者和16名健康对照者，所有参与者均来自波兰格但斯克医学大学过敏科的本地注册系统。该系统是欧洲肥大细胞增多症专业网络（European Competence Network on the Mastocytosis, ECNM）的一部分。所有样本均通过全外周血采集，使用Illumina平台进行靶向测序，以确保对特定基因区域的精确分析。

研究结果揭示了多个在SM患者中显著差异的基因变异。这些变异主要集中在DNMT3A、SETD2、TET2和BRD4这四个基因上，分别位于染色体2、3、4和19上。其中，TET2基因的两个变异和DNMT3A、SETD2、BRD4各一个变异均表现出显著的统计学意义。值得注意的是，尽管这些基因已被广泛研究并与肥大细胞增多症相关，但其中两个变异此前未在文献中被报道过，这为该疾病的研究提供了新的方向。通过曼哈顿图分析，研究团队能够直观地展示这些变异在基因组中的分布情况，并确认它们与SM之间的潜在联系。

进一步分析显示，这些基因变异可能在不同临床亚型中发挥不同的作用。例如，DNMT3A基因的突变可能影响DNA甲基化水平，从而改变肥大细胞的活性和增殖能力。DNMT3A是一种DNA甲基转移酶，负责调控基因表达。在SM患者中，该基因的突变可能破坏正常的DNA甲基化调控机制，导致肥大细胞的异常激活和增殖。在本研究中，发现DNMT3A基因的一个变异位于染色体2上的特定位置，导致四个核苷酸的缺失，从而引发移码突变。这种突变通常会导致蛋白质提前终止，使其失去正常功能，进而影响肥大细胞的行为。此外，DNMT3A的其他类型突变（如无义突变、剪接位点突变等）也被认为可能影响SM患者的临床表现，尤其是在中等风险群体中更为常见。

SETD2基因的变异同样值得关注。SETD2是一种组蛋白甲基转移酶，参与DNA损伤修复和转录调控。其功能的丧失可能改变基因表达模式，从而支持肥大细胞的增殖和存活。在本研究中，发现SETD2基因的一个变异位于染色体3上，属于沉默突变。这种突变不会改变蛋白质的氨基酸序列，但可能通过影响翻译效率来改变基因的功能。已有研究表明，沉默突变可以通过改变蛋白质折叠的时间，从而影响其最终结构和功能。因此，SETD2的这种变异可能在SM的发病过程中起到间接作用，尤其是在表观遗传调控的背景下。

TET2基因的两个变异则涉及氨基酸序列的改变。其中，一个变异将Val替换为Methione或Leucine，另一个则是Val替换为Leu。这种错义突变可能导致蛋白质折叠发生变化，从而影响其正常功能。尽管这些变异在文献中尚未被报道，但它们可能在SM的进展中起到关键作用。TET2是一种重要的DNA去甲基化酶，参与维持正常的造血功能。其功能的异常可能破坏DNA甲基化调控，进而导致肥大细胞的异常激活，从而促进SM的发展。

BRD4基因的变异则可能通过影响转录调控来间接参与SM的病理过程。BRD4是一种与染色质重塑相关的蛋白，能够识别乙酰化的组蛋白，并在炎症和免疫反应中发挥作用。尽管目前尚未有直接证据表明BRD4突变与SM相关，但其在ASM和MCL中的高表达提示其可能在疾病进展中起到一定作用。近年来，BRD4因其在高级SM中的潜在治疗价值而受到关注，这使得它成为未来研究的重要候选目标。

研究还指出，SM的发病机制不仅仅是单一基因突变的结果，而是遗传和表观遗传因素共同作用的结果。例如，ISM患者表现出DNA去甲基化的减少，这可能与免疫通路的表观遗传激活有关。相比之下，非过敏性患者的DNA甲基化水平较高，这可能与更严重的肥大细胞功能障碍或不同的表观遗传背景相关。此外，基因表达谱的分析也显示，SM患者的骨髓中存在与肥大细胞功能相关的基因（如TPSAB1、ATF3、MAFF）的过度表达，这些基因的表达水平与血清中组胺释放相关蛋白——tryptase的浓度密切相关。在更严重的SM亚型中，如ASM和MCL，基因表达的异常更为显著，涉及KIT、CD25、免疫相关基因（如IL1R1、CCL23、CD4）以及一些调控蛋白（如LAT2、CD33、CDH12、CD81）的表达变化。

这些发现不仅支持了表观遗传学在SM发病和进展中的重要性，还为未来的诊断和治疗策略提供了新的思路。例如，利用高通量测序技术（如NGS）和数字PCR等先进方法，可以更精确地识别与SM相关的基因变异，并评估其在不同亚型中的作用。此外，研究还提到，尽管KIT突变是SM的主要驱动因素，但其他基因的变异可能在特定的临床背景下影响疾病的严重程度和预后。因此，未来的研究需要进一步扩大样本规模，以更全面地验证这些变异的临床意义，并探索它们在SM治疗中的潜在应用。

在方法学方面，研究团队采用了一种系统化的策略，首先通过NGS对110个候选基因进行靶向测序，以识别可能的体细胞突变。随后，通过定量实时PCR（qPCR）评估这些基因的表达水平，以确认其在SM患者中的功能变化。此外，为了确保数据的准确性，研究团队进行了严格的质控步骤，包括去除低质量序列、去重以及使用生物信息学工具验证序列比对。在样本处理过程中，采用了磁珠纯化技术，以确保DNA片段的高质量和完整性。

研究还涉及了基因组变异的详细分析，包括染色体位置、受影响的基因、特定的外显子以及变异类型。这些信息对于理解基因变异如何影响蛋白质功能和疾病进程至关重要。例如，某些变异可能影响基因的编码区域，导致蛋白质结构的改变；而另一些变异可能位于非编码区域，通过改变基因表达水平或调控机制来发挥作用。此外，研究团队还对变异的临床意义进行了初步探讨，例如某些变异是否与特定的临床亚型或症状相关。

总的来说，本研究为SM的遗传和表观遗传机制提供了新的证据，并揭示了多个可能参与该疾病进展的基因变异。这些变异不仅与KIT突变并存，还可能通过不同的途径影响肥大细胞的行为和疾病的表现。未来的研究需要进一步验证这些发现，并探索它们在诊断、预后评估和治疗中的应用潜力。此外，研究还强调了多学科合作的重要性，包括遗传学、表观遗传学、免疫学和临床医学，以更全面地理解SM的复杂性并开发更有效的治疗策略。