乳腺癌肿瘤内微生物组在恶性转化与治疗过程中的动态演变：精准肿瘤学新视角

　　本研究通过高深度16S rRNA测序技术，首次系统揭示了乳腺癌发生（从良性结节恶性转化）、发展（不同TNM分期）及治疗（新辅助疗法NAT响应）过程中肿瘤内微生物组的动态演变规律。研究发现Aeromicrobium/Halomonas/Dietzia/Nesterenkonia/Delftia/Nitriliruptor等菌群在恶性转化过程中被耗竭，而Paenibacillus和Methyloversatilis呈相反趋势。通过FISH/TEM证实Paenibacillus pasadenensis和Halomonas hamiltonii定植于肿瘤细胞内，并分别促进/抑制肿瘤增殖迁移。研究进一步构建了结节恶性风险分层和NAT疗效预测模型（AUC达0.98和0.77），为乳腺癌精准防治提供了微生物组学新策略。

　　

研究背景与意义

乳腺癌（BC）作为全球女性最常见的恶性肿瘤，2022年新发病例达230万，死亡病例66.6万，占女性新发癌症的23.8%和癌症相关死亡的15.4%。尽管影像学技术的进步使乳腺结节早期检出率显著提升，但传统方法对结节恶性转化风险的预测能力有限。近年来，肿瘤内微生物组（包括细菌、病毒和真菌）在肿瘤发生发展中的作用备受关注。从幽门螺杆菌与胃癌的关联到多种肿瘤中微生物组的证实，研究表明乳腺癌组织中Pseudomonas、Proteus、Nitrosomonas等菌属富集，而Sphingomonas和Corynebacterium减少。然而现有研究多局限于横断面设计，难以捕捉微生物组在恶性转化过程中的动态变化。本研究通过纵向队列设计，首次系统解析乳腺癌发生、发展和治疗过程中肿瘤内微生物组的动态演变规律。

研究方法与队列设计

研究纳入三大队列：165例良性结节（82例未转化NNT组，83例后续恶变NDT组并匹配癌组织）、180例原发性乳腺癌和165例良性对照组织、101例新辅助治疗（NAT）标本（15例pCR，86例非pCR且含配对待治疗样本）。采用110,000 tags/样本的高深度16S rRNA测序（V3-V4区），经FLASH拼接、Trimmomatic质控、DADA2去噪获得高分辨率ASV，通过RDP Classifier（置信阈值0.8）参考Silva数据库进行物种注释。α多样性采用Chao1/ACE/Shannon/Simpson指数，β多样性基于Binary Jaccard距离进行PCoA和ANOSIM分析。差异微生物鉴定采用LEfSe（LDA>4），网络分析通过ggClusterNet计算拓扑参数，功能预测使用PICRUSt2参照KEGG/COG数据库。机器学习模型（RF/SVM/LR）以微生物丰度、代谢通路和临床特征为输入，通过5折交叉验证和外部队列验证性能，并采用SHAP值解析特征重要性。实验验证包括TEM/FISH观察细菌定位，以及细菌感染后通过Transwell/Edu/克隆形成实验评估癌细胞增殖迁移能力。

良性结节恶性转化中的微生物动态

NDT组与NNT组基线特征匹配（中位年龄54 vs 55岁），病理均以腺病为主。α多样性显示NDT组ACE/Chao1/Shannon指数显著降低（p<0.05）。β多样性揭示两组群落结构显著差异（R=0.46, p=0.001）。微生物网络分析表明：NNT组网络密集稳定（199边/33节点/5.5%负边），NDT组网络稀疏化（67边/36节点/22.4%负边），平均度和聚类系数下降，表明恶性转化前微生物协作减少、竞争增强。

门水平上两组均以Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidota、Actinobacteriota为主（占比80%-90%）。LEfSe分析发现NDT组富集Bacteroides、Weissella、Paenibacillus、Methyloversatilis，NNT组富集Halomonas、Dietzia、Nesterenkonia、Aeromicrobium（LDA>4）。种水平上Methyloversatilis discipulorum、Paenibacillus pasadenensis、Weissella cibaria、Bosea vestrisii在NDT组升高，而Dietzia natronolimnaea、Aeromicrobium halocynthiae、Halomonas hamiltonii、Nesterenkonia sp.10004降低（p<0.05）。功能分析显示NNT组氨基酸代谢和脂代谢通路显著活跃，NDT组糖代谢增强（p<0.05）。

恶性转化过程的微生物轨迹

配对分析显示良性→恶性阶段α多样性无显著变化，但β多样性差异显著（R=0.328, p=0.001）。门水平上恶性组织Actinobacteriota增加，Bacteroidota和Firmicutes减少。种水平上33属49种显著差异：Aeromicrobium、Dietzia、Halomonas、Nesterenkonia在肿瘤期富集，Paenibacillus和Acinetobacter减少。具体种如Aeromicrobium halocynthiae、Delftia acidovorans、Dietzia natronolimnaea、Halomonas hamiltonii、Nesterenkonia属种、Nitriliruptor alkaliphilus在恶变中上升，Acinetobacter lwoffii和Paenibacillus pasadenensis下降（p<0.05）。肿瘤组织微生物网络更复杂（边/节点数增加），功能上氨基酸代谢增强、糖代谢减弱。

乳腺癌与良性病变的微生物差异

乳腺癌组Shannon(6.19vs6.60)/ACE(395.01vs587.11)/Chao1(393.14vs584.80)指数均低于良性组（p<0.01）。β多样性存在细微差异。属水平上肿瘤组富集Methyloversatilis、Weissella、Bosea，良性组富集Delftia、Dietzia、Halomonas、Aeromicrobium、Nesterenkonia。种水平上Methyloversatilis discipulorum、Bosea vestrisii、Sphingobium xenophagum在肿瘤组织增多，Delftia sp.、Dietzia natronolimnaea、Aeromicrobium halocynthiae、Halomonas hamiltonii在良性组织增多（p<0.05）。网络分析显示肿瘤组网络更协作（264边/44节点/76.9%正边），良性组网络更大但协调性低（363边/51节点/69.3%正边）。功能预测显示肿瘤组微生物富集于肿瘤相关通路、抗癌药耐药、细胞运动及生长死亡通路。

微生物与临床特征关联

按TNM分期（DCIS/I/II/III期）分析发现：随肿瘤进展，微生物网络简化（DCIS期744边/138节点→III期135边/58节点），平均度下降(10.78→4.65)，负边降至6.7%，提示晚期肿瘤微生物竞争减弱。LEfSe显示III期Weissella和Bacteroides增加，DCIS期Aeromicrobium富集。Dietzia natronolimnaea、Aeromicrobium halocynthiae、Nesterenkonia sp.10004、Halomonas hamiltonii、Nitriliruptor alkaliphilus随分期进展递减，Paenibacillaceae pasadenensis递增（p<0.05）。

分子分型关联分析显示：ER-/PR-组Methyloversatilis、Caulobacter、Sphingobium、Rikenella升高；HER2低表达组Desulfobulbus、C1_B045、NS5_marine_group、Albimonas减少；Ki-67高增殖组Mucispirillum、Erysipelatoclostridium、Taibaiella增加，低增殖组Desulfobulbus、Halonotius、Pseudothermotoga增多。

新辅助治疗的微生物响应

NAT后Chao/ACE指数显著变化，β多样性偏移（R=0.21, p=0.001）。门水平上post-NAT期Actinobacteriota增加，Firmicutes减少。属/种水平上Aeromicrobium、Halomonas、Dietzia、Nitriliruptor、Nesterenkonia及对应种在治疗后富集，Acinetobacter和Paenibacillus减少（p<0.05）。治疗后网络边数显著增加（93→411），节点扩至62个，聚类系数稳定。功能上氨基酸代谢和脂代谢通路上调，糖生物合成代谢下降。

pCR与非pCR患者的微生物差异

101例NAT患者中pCR组15例与非pCR组86例在年龄/Ki67/TNM分期/分子分型/αβ多样性上无显著差异。LEfSe显示pCR组Sphingobacteriales富集，非pCR组Actinobacteriota增多。种水平上pCR组Ruminococcus lactaris、Megamonas funiformis、Faecalibacterium prausnitzii、Eubacterium rectale减少（p<0.05）。pCR组网络更复杂（640边/139节点/83.4%正边），平均度(9.2vs5.23)和聚类系数(0.45vs0.60)更高。Miller-Payne分级热图显示Sphingomonas、Sphingobium、Novosphingobium在MP5级富集，中间级过渡菌群如Ruminococcus_gauvreauii_group、Tissierella、Saccharomonospora、Azospirillum_sp._47_25增多。

预测模型构建与验证

结节恶性转化预测模型中RF性能最佳（AUC=0.98），外部验证AUC=0.84。SHAP分析关键特征包括"脂肪酸降解"、"萜类骨架生物合成"、"缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸降解"通路及Prauserella、Salipaludibacillus、Nitriliruptor、Dietzia、Halomonas、Aeromicrobium等菌属。

NAT响应预测模型中RF的AUC达0.77，优于LR(0.76)和SVM(0.48)。重要特征包括2-氧羧酸代谢、苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸生物合成、精氨酸生物合成通路、Subdoligranulum、Megamonas、unclassified Clostridia UCG-014菌属以及Ki-67指数、HER2状态和年龄。外部验证AUC=0.72，准确率75%。

细菌功能的实验验证

TEM和FISH证实Paenibacillus pasadenensis和Halomonas hamiltonii定植于肿瘤细胞内。细胞实验显示：Halomonas hamiltonii感染显著抑制MDA-MB-231和MCF-7细胞迁移、增殖（Edu assay）和克隆形成；Paenibacillus pasadenensis则促进这些恶性表型（p<0.05）。机制上，Halomonas可能通过产生硫酸化多糖诱导凋亡、抑制血管生成，或通过L-谷氨酰胺酶耗竭谷氨酰胺阻断蛋白合成；Paenibacillus可能通过调节炎症反应和代谢通路促瘤。

微生物功能机制探讨

微生物可能通过代谢重编程影响肿瘤微环境：①氨基酸代谢（谷氨酰胺/精氨酸）调节免疫细胞功能；②糖酵解增强Warburg效应，营造酸性免疫抑制环境（如Fusobacterium nucleatum调控GLUT1/ENO1）；③脂代谢通过FASN酶促进脂质合成介导化疗耐药；④分泌短链脂肪酸（如丁酸盐）诱导Treg分化抑制树突细胞成熟。Methyloversatilis discipulorum可能通过上调GOLM1招募MDSC、增强PD-L1稳定性抑制CD8⁺T细胞功能；Paenibacillus促炎促瘤；Halomonas/Aeromicrobium通过抗氧化/促凋亡抑瘤。

微生物动态的悖论与解读

恶性转化初期Aeromicrobium/Halomonas/Dietzia/Nesterenkonia等暂时升高，可能参与早期微环境调控（免疫激活/代谢竞争），但随着肿瘤进展（缺氧/免疫抑制/代谢紊乱）而递减，反映微生物组在肿瘤发生中的双相角色：早期试图维持稳态，晚期被抑制并让位于促瘤菌群。

研究局限与展望

本研究局限性包括：①需进一步明确特定菌种的功能机制；②缺乏多组学数据难以解析宿主-微生物互作；③回顾性数据需前瞻性多中心验证。未来需开展菌株功能验证、多组学整合及微生物靶向干预研究。

结论

本研究首次绘制了乳腺癌发生发展及治疗过程中肿瘤内微生物组的动态演变图谱，揭示Paenibacillus的促瘤作用和Halomonas/Delftia/Dietzia/Nesterenkonia/Aeromicrobium的抑瘤潜力，构建了基于微生物组的恶性转化和NAT响应预测模型，为乳腺癌精准防治提供了新的微生物靶点和决策工具。