细胞外基质纳米纤维的生化和生物物理特性调控iPSC衍生的人类肝细胞成熟过程

《Journal of Biomedical Materials Research Part A》：Biochemical and Biophysical Properties of Extracellular Matrix Nanofibers Modulate iPSC-Derived Human Hepatocyte Maturation

　　本研究通过电纺技术制备了胶原蛋白I、壳聚糖、 porcine liver ECM（PLECM）及其混合物的纳米纤维，发现自然ECM纳米纤维能显著促进iPSC-HLCs的成熟，表现为更高的ALB分泌和CYP3A4酶活性，其机制与纳米纤维的拓扑结构和刚度调控YAP-TAZ信号通路相关。相比 stiff PVA纳米纤维，软纳米纤维（如chitosan/collagen）能更有效抑制YAP核转位，提升肝细胞功能。该成果为构建更精准的肝脏模型提供了新思路。

　　在现代生物医学研究中，人类肝脏模型的构建和优化已成为药物研发、疾病机制研究以及再生医学等领域的关键任务。肝脏细胞在体内不仅具有复杂的生理功能，还与周围环境中的细胞外基质（ECM）密切相关。因此，实验室中培育的肝脏模型需要尽可能模拟真实肝脏的结构和功能，以确保其在研究中的可靠性和实用性。然而，目前常用的初级人肝细胞（PHHs）由于其稀缺性和容易发生去分化，难以满足大规模研究的需求。相比之下，诱导多能干细胞（iPSC）来源的肝细胞样细胞（HLCs）因其可再生性和易于大规模生产而成为一种极具潜力的替代方案。但HLCs在功能成熟度方面仍存在不足，特别是在药物代谢酶活性方面，仍无法达到PHH的水平。

为了解决这一问题，研究者们探索了如何通过调控ECM的组成、刚度和结构来改善HLCs的成熟度。ECM不仅是细胞的物理支撑结构，还通过多种生物化学信号影响细胞的分化、迁移和功能。因此，研究中采用了一种新型的纳米纤维材料，利用电纺技术制造出由胶原蛋白I、壳聚糖、猪肝ECM（PLECM）及其混合物构成的ECM纳米纤维。这些纳米纤维的结构和物理特性能够更好地模拟肝脏的自然微环境，从而促进HLCs的成熟。研究结果表明，HLCs在这些ECM纳米纤维上培养超过3周后，其功能成熟度显著高于在传统Geltrex涂层的玻璃表面培养的情况。特别是壳聚糖/胶原蛋白纳米纤维，表现出比具有相似刚度的ECM水凝胶或吸附在玻璃上的蛋白质更高的细胞功能表现，突显了纳米尺度拓扑结构的重要性。

相比之下，刚度更高的聚乙烯醇（PVA）纳米纤维并未带来HLCs的显著成熟度提升，这与YAP蛋白的核内活性增加有关。YAP作为细胞对机械刺激的感知信号分子，其核内定位能够影响细胞的分化方向。在更坚硬的PVA纳米纤维上，HLCs的YAP蛋白核内活动增强，这可能抑制了其向成熟肝细胞的转化。这一发现表明，ECM的刚度和拓扑结构对HLCs的成熟具有协同作用，而单纯的刚度调控可能不足以实现理想的细胞功能提升。

为了进一步验证这一结论，研究团队设计了不同的实验条件，包括ECM纳米纤维、水凝胶以及吸附在玻璃上的ECM材料。通过原子力显微镜（AFM）和扫描电子显微镜（SEM）等技术，研究人员对这些材料的表面形貌和机械性能进行了详细分析。结果显示，纳米纤维的刚度范围在2 MPa左右，而PVA纳米纤维的刚度高达94.4 MPa，远高于自然ECM材料。此外，纳米纤维的直径和孔隙率在不同处理后保持相对稳定，这为研究其对细胞行为的影响提供了良好的基础。

在细胞分化方面，iPSCs在这些ECM纳米纤维上经过5天的诱导形成内胚层（DE）细胞，随后在15天内进一步分化为HLCs。免疫荧光分析显示，所有ECM纳米纤维都促进了DE标志物如SOX17和FOXA2的表达，而壳聚糖和壳聚糖/胶原蛋白纳米纤维更倾向于形成细胞聚集体，这可能与它们的3D结构有关。对于HLCs，所有纳米纤维都显著提高了HNF4A、ALB和CK8等标志物的表达水平，其中壳聚糖/胶原蛋白纳米纤维表现尤为突出。在功能层面，这些HLCs在壳聚糖、壳聚糖/胶原蛋白和PLECM/胶原蛋白纳米纤维上表现出更高的白蛋白分泌和CYP3A4活性，这些指标是评估肝细胞成熟度的重要依据。

此外，研究还发现，HLCs在纳米纤维上的成熟度显著高于在传统玻璃控制组上的表现。例如，K3 iPSC来源的HLCs在壳聚糖/胶原蛋白纳米纤维上，其白蛋白分泌量是玻璃控制组的5至21倍，CYP3A4活性则达到5至35倍。而另一条iPSC线SCN5A1043来源的HLCs虽然也表现出一定的成熟度提升，但其幅度相对较小，仅在1.3至1.8倍之间。这表明不同iPSC来源的细胞对ECM材料的反应存在差异，可能与原始细胞来源的表观遗传记忆有关。

研究还探讨了ECM拓扑结构对HLCs成熟的影响。通过比较不同结构的ECM材料，如纳米纤维、水凝胶和吸附在玻璃上的ECM，发现纳米纤维在促进HLCs成熟方面具有明显优势。水凝胶虽然具有相似的刚度，但其表面光滑度较低，导致HLCs的附着和迁移能力受限，进而影响其功能成熟。而吸附在玻璃上的ECM虽然提供了一定的生物化学信号，但其对HLCs的促进作用不如纳米纤维显著。这表明，ECM的拓扑结构在调控细胞行为和功能方面起到了至关重要的作用。

为了进一步分析刚度对HLCs成熟的影响，研究团队还比较了PVA纳米纤维和壳聚糖/胶原蛋白纳米纤维。结果显示，PVA纳米纤维的刚度虽然较高，但并未带来HLCs功能的显著提升，反而导致YAP核内活动增加，这可能抑制了HLCs的成熟。这说明刚度并不是决定HLCs成熟度的唯一因素，ECM的组成和拓扑结构同样重要。例如，壳聚糖/胶原蛋白纳米纤维的刚度较低，但其表面的纳米结构促进了HLCs的分化和功能表达。

综上所述，这项研究揭示了ECM纳米纤维在促进iPSC来源的HLCs成熟方面的重要作用。通过调控ECM的组成、刚度和结构，研究人员成功地提升了HLCs的功能表现，使其更接近PHH的水平。这些发现为构建更准确的人类肝脏模型提供了新的思路，也为药物筛选、疾病建模和再生医学应用提供了可靠的实验基础。未来的研究可以进一步探索如何通过结合不同ECM材料的优势，优化纳米纤维的结构和功能，从而推动其在生物医学领域的广泛应用。