在骨芯片系统中，利用三周期最小曲面支架进行几何引导的骨生成

《Advanced Healthcare Materials》：Geometry-Guided Osteogenesis in Bone-on-a-Chip Systems Using Triply Periodic Minimal Surface Scaffolds

　　骨-芯片系统结合拓扑周期极小曲面（TPMS）三维支架，研究几何参数与流体剪切应力对成骨作用的调控。通过Gyroid和Schwarz diamond两种TPMS结构，控制孔隙形状和固度，发现中等固度的支架（如SD_U_0.3）在流体剪切应力（0.0088-0.0091 Pa）下显著促进ALP活性、钙沉积及胶原形成，较静态培养提升2-3倍。微流控芯片有效模拟生理流体动力学，揭示孔隙尺寸阈值（>800 μm时矿化抑制），且Gyroid结构因均匀应力分布优于Schwarz diamond。研究表明，固度与拓扑结构的协同优化可显著提升骨再生效率。

　　在骨组织工程和再生医学领域，如何通过设计和调控支架结构来优化骨生成过程一直是研究的重点。本文探讨了支架几何形状与机械信号之间的相互作用，并通过开发一种名为“骨芯片”（Bone-on-a-Chip, BoC）的系统，结合三重周期性最小曲面（Triply Periodic Minimal Surface, TPMS）结构的三维支架，研究了在动态灌流条件下，支架的几何参数如何影响成骨细胞的生物学行为。通过将支架嵌入微流控芯片中，研究人员能够更精确地模拟生理环境，并观察细胞在不同几何结构下的响应，包括细胞浸润、碱性磷酸酶（ALP）活性、钙沉积和胶原蛋白形成等关键指标。

### 一、研究背景与意义

骨组织是高度动态的结构，其内部具有复杂的多孔性。这种多孔结构不仅影响骨的机械性能，还对细胞的粘附、增殖和分化起着重要作用。因此，开发具有类似自然骨结构的支架对于实现有效的骨再生至关重要。然而，传统方法在精确控制多孔结构方面存在局限，例如泡沫法、溶胶-凝胶法和冻干法等，难以精确调控孔隙形状、孔隙大小和连通性。为了解决这一问题，近年来，研究人员开始关注基于TPMS结构的支架，因其能够提供更均匀的应力分布，同时具备高表面与体积比（SVR）和高度互联的多孔网络，有利于细胞增殖和组织形成。

TPMS结构具有平滑的表面，能够减少应力集中，从而提高支架的机械性能。此外，其高SVR和良好的渗透性有助于营养物质的输送和代谢废物的排出，从而促进细胞在支架中的分布和生长。然而，目前多数体外研究仍依赖于静态培养条件，这与体内骨组织所经历的动态机械环境存在差距。为了弥补这一缺陷，研究团队开发了BoC系统，该系统能够提供更接近生理条件的动态灌流环境，从而更准确地评估支架几何结构对细胞行为的影响。

### 二、TPMS支架的几何设计与性能评估

研究中使用的TPMS结构包括Gyroid和Schwarz Diamond（SD）两种类型。每种结构均设计了具有不同固度（solidity）和梯度的支架，以探讨其对细胞行为的影响。固度是指支架中固体部分所占的比例，而孔隙形状和大小则决定了支架的机械性能和细胞响应。通过调整TPMS结构的参数，研究团队成功制造了具有不同孔隙特性的支架，并对其机械性能进行了系统评估。

在机械测试中，研究人员发现，不同固度的支架表现出不同的压缩模量和承载能力。总体而言，固度越低的支架具有更高的孔隙率，但其机械强度相对较弱；而固度较高的支架则表现出更强的机械性能，但其渗透性较差，可能限制细胞的迁移和分布。此外，梯度支架在设计上模拟了骨组织从松质骨向密质骨过渡的结构特征，例如在径向梯度支架中，固度从中心向外围逐渐增加，而在顺时针梯度支架中，固度沿环形方向递增。这些设计差异对细胞的分布和行为产生了显著影响。

### 三、BoC系统的构建与优化

BoC系统的核心在于其微流控结构，能够提供可控的流体流动条件，从而模拟体内骨组织所经历的动态机械刺激。为了优化流速，研究团队进行了多种流速的灌流实验，发现流速为2 mL/min时，能够实现较为均匀的流体分布和适宜的壁剪切应力（WSS），而流速为4 mL/min时则容易引发流体扰动，甚至导致回流现象，这可能影响细胞的正常行为。因此，最终选择了2 mL/min作为最佳流速，以确保流体环境的稳定性和一致性。

此外，通过计算流体力学（CFD）模拟，研究人员进一步验证了不同流速和支架结构对WSS分布的影响。模拟结果表明，在2 mL/min的流速下，WSS分布较为均匀，且接近体内骨组织所经历的生理范围。而在1 mL/min的流速下，WSS值较低，可能不足以激活骨生成相关信号。因此，BoC系统能够提供一种更接近体内条件的体外培养环境，从而更好地揭示支架几何结构对细胞行为的影响。

### 四、细胞行为与骨生成的响应分析

研究团队在BoC系统中评估了MC3T3-E1细胞在不同支架结构下的行为，包括细胞增殖、浸润、ALP活性、钙沉积和胶原蛋白形成等。结果显示，在静态条件下，不同孔隙结构对细胞行为的影响较为有限，但随着动态灌流的引入，支架几何结构对细胞行为的调控作用显著增强。

在动态灌流条件下，固度较低的支架（如G_U_0.2和SD_U_0.2）表现出较高的细胞密度，这可能与流体流动带来的机械刺激有关。流体流动能够促进细胞的均匀分布，提高营养物质的输送效率，并增强细胞对机械信号的响应。然而，当孔隙过大时，流体速度和WSS水平会升高，这可能导致细胞过早进入分化阶段，但随后的矿化和胶原沉积反而受到抑制。因此，存在一个最佳的孔隙尺寸和WSS范围，以支持骨生成过程。

另一方面，固度较高的支架（如SD_U_0.3）在动态灌流条件下表现出更优的矿化能力。这表明，虽然孔隙形状在一定程度上影响细胞行为，但固度和孔隙大小对骨生成的调控更为关键。此外，CFD模拟还揭示了不同TPMS结构对流体流动的调控差异。例如，在Gyroid结构中，流体更容易进入支架内部，从而产生较高的WSS，而在SD结构中，流体流动则更加均匀，有助于细胞的长期分化和矿化。

### 五、细胞外基质（ECM）与胶原蛋白的形成

胶原蛋白是骨组织的重要组成部分，其形成与细胞的分化和矿化密切相关。在动态灌流条件下，SD_U_0.3支架表现出更高的胶原沉积，这与其较低的WSS水平和较好的流体渗透性有关。而Gyroid结构的胶原沉积则相对较低，这可能与其较高的WSS水平和较差的流体均匀性有关。

此外，研究还发现，不同孔隙结构对胶原蛋白的沉积存在细微差异。例如，SD结构的弯曲特性可能促进了胶原蛋白的组织和排列，而Gyroid结构则可能在一定程度上限制了这一过程。这表明，支架的曲率和拓扑结构在调控细胞外基质形成方面也发挥着重要作用。

### 六、基因表达分析与信号通路调控

为了进一步揭示支架几何结构对细胞行为的影响机制，研究团队还进行了基因表达分析。结果显示，在动态灌流条件下，不同固度的支架对骨生成相关基因（如RUNX2、SP7、Dlx5）的表达存在显著差异。例如，SD_U_0.2支架在静态和动态条件下均表现出较高的RUNX2表达，这可能与其较大的孔隙和较低的固度有关。而SD_U_0.3支架则在动态条件下表现出更高的ALP活性和胶原沉积，这可能与其优化的WSS水平和流体分布有关。

此外，研究还发现，动态灌流条件下的细胞行为与静态条件存在明显差异。例如，在动态条件下，细胞的分化和矿化过程更加活跃，而在静态条件下，细胞的增殖和分布则受到一定限制。这表明，流体流动不仅能够提供机械刺激，还可能通过调控信号通路（如Wnt/β-catenin、BMP/TGF-β、MAPK等）影响细胞的分化和功能。

### 七、研究的启示与未来方向

本研究揭示了支架几何结构与动态灌流环境之间的协同作用，为设计更高效的骨组织工程支架提供了理论依据。具体而言，适当的孔隙形状和固度能够优化WSS分布，从而促进细胞的分化和矿化。然而，过大的孔隙尺寸可能导致WSS过高，进而抑制骨生成过程。因此，未来的支架设计需要在孔隙大小和WSS水平之间找到平衡点，以确保支架既能提供足够的机械刺激，又能维持细胞的正常功能。

此外，本研究还指出，TPMS结构的曲率和拓扑特性对细胞行为具有微妙但重要的影响。例如，SD结构的弯曲特性可能促进了细胞的附着和胶原沉积，而Gyroid结构则可能在某些条件下表现出不同的响应模式。因此，在设计TPMS支架时，需要综合考虑其几何特性和流体流动条件，以实现最佳的骨生成效果。

为了进一步拓展研究范围，未来的工作可以探索更多复杂的细胞环境，如共培养成骨细胞和破骨细胞，或者使用间充质干细胞（MSCs）来更好地模拟体内骨生成和重塑过程。此外，研究还可以扩展到不同材料的TPMS支架，例如临床相关的钛合金或可降解聚合物，以验证这些结构在不同材料平台上的适用性。

总之，本研究通过结合TPMS结构和BoC系统，提供了一种新的方法来评估支架几何结构对骨生成过程的影响。这一平台不仅能够更准确地模拟体内条件，还能够揭示机械刺激与细胞行为之间的复杂关系，为骨组织工程和再生医学的发展提供了重要的理论支持和技术参考。