利用基于多重高分辨率质谱技术的伪靶向脂质组学方法筛选用于慢性阻塞性肺疾病（COPD）诊断的生物标志物

《Journal of Chromatography B》：Screening biomarkers for diagnosis of COPD by multiplex-high-resolution mass spectrometry based pseudotargeted lipidomics

　　基于高分辨质谱（HRMS）的多路伪靶向脂质组学方法在COPD诊断中的应用，通过HRMS与QQQ质谱联用，结合多路扫描模式提高数据采集效率，筛选出460种脂质进行定量分析，发现47种差异脂质作为COPD潜在生物标志物。

　　脂质组学作为生命科学领域的重要研究方向，近年来因其在揭示生物体内部复杂代谢网络中的关键作用而受到广泛关注。脂质不仅参与细胞膜结构的构建，还在信号转导、能量储存及物质运输等生理过程中发挥着不可替代的功能。因此，对脂质变化的全面分析对于理解疾病机制、开发诊断标志物和探索治疗策略具有重要意义。当前，脂质组学研究主要依赖于两种策略：非靶向分析和靶向分析。非靶向脂质组学能够覆盖广泛的脂质种类，其优势在于无需预设目标分子，通过高分辨率质谱（HRMS）技术可以全面扫描生物样本中的所有离子特征。然而，非靶向方法在扫描速度和数据处理方面存在一定的局限性，尤其是在全扫描模式下，质谱仪需要在极短时间内扫描大量离子，容易导致设备饱和，从而影响数据的准确性和完整性。

相比之下，靶向脂质组学通常采用三重四极杆质谱（QQQ MS）技术，通过多反应监测（MRM）等选择性扫描模式实现对特定脂质分子的高灵敏度检测。这种策略的优点在于其较高的定量准确性和重复性，但其覆盖范围相对较小，通常局限于已有标准品的脂质种类。因此，如何在保持高覆盖范围的同时提高定量准确性，成为脂质组学研究中亟待解决的问题。

为了解决这一矛盾，研究者们提出了伪靶向脂质组学（pseudotargeted lipidomics）这一新型方法。伪靶向策略通过从非靶向数据中筛选出具有代表性特征的脂质离子对，构建出一套能够兼顾广泛覆盖与高定量精度的分析方法。这一方法通常基于高分辨率质谱（HRMS）获取的脂质前体离子和产物离子信息，再通过三重四极杆质谱进行定量分析。然而，QQQ质谱的分辨率较低，可能导致在峰积分和方法转换过程中出现错误的峰识别，从而影响结果的可靠性。

针对上述问题，本研究提出了一种基于高分辨率质谱的伪靶向脂质组学构建方法，即多路复用高分辨率质谱伪靶向脂质组学（Multiplex-HRMS-based pseudotargeted lipidomics, MHPL）。该方法的核心在于利用HRMS的高分辨率特性，获取精确的脂质前体离子和产物离子信息，同时结合多路复用模式（multiplex mode）提高扫描效率。多路复用模式能够在单个隔离窗口内同时对多个共洗脱的脂质前体离子进行碎片化处理，并同步采集其MS/MS质量谱数据，从而识别出每个脂质分子的特异性产物离子（Unique Product Ions, UPIs）。这些UPIs被定义为可定量产物离子（Quan-PIs），用于后续的定量分析。这种方法不仅提高了扫描速度，还显著减少了由于分辨率不足导致的错误峰识别问题。

为了实现这一目标，研究团队开发了一系列脚本工具，用于在多路复用模式下快速筛选脂质的Quan-PIs。这些脚本能够自动化处理HRMS数据，提取出具有代表性的离子对，并进一步优化其用于定量分析的可行性。通过这种方法，研究人员能够在五次进样内准确定量460种脂质分子，显著提升了分析效率和数据质量。此外，该方法在临床样本分析中展现出良好的应用前景，特别是在慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者血清差异脂质的发现中。研究结果显示，共有47种差异脂质被识别，这些脂质可能构成COPD诊断的潜在生物标志物。

本研究的意义在于，它为脂质组学研究提供了一种新的解决方案，既保留了HRMS在离子识别和分离方面的优势，又克服了其扫描速度慢的不足。同时，通过引入多路复用模式和相应的脚本工具，提高了伪靶向方法的实用性和可操作性。这一方法的提出，不仅有助于提高脂质定量分析的准确性，也为未来大规模、高通量的脂质组学研究奠定了基础。

在实际应用中，该方法已被成功应用于COPD患者的血清样本分析。COPD是一种与脂质代谢紊乱密切相关的重要呼吸系统疾病，其病理特征包括气道阻塞、肺泡结构破坏和慢性炎症反应。由于脂质在疾病发生发展过程中扮演着重要角色，因此对COPD患者血清中脂质变化的系统研究具有重要意义。通过MHPL方法，研究人员能够更高效地识别和定量与COPD相关的脂质分子，从而为疾病的早期诊断和个体化治疗提供新的思路。

此外，该方法还具有一定的通用性，可以应用于其他与脂质代谢相关的疾病研究，如心血管疾病、糖尿病和神经退行性疾病等。这些疾病均与脂质代谢异常密切相关，而MHPL方法能够提供更全面、准确的脂质信息，有助于揭示疾病的分子机制并开发新的治疗靶点。同时，该方法在样本处理和数据采集过程中减少了人为干预，提高了实验的可重复性和数据的可靠性。

在实验设计和数据处理方面，本研究采用了系统化的流程。首先，通过HRMS对生物样本中的脂质进行全面扫描，获取其前体离子和产物离子的详细信息。随后，利用多路复用模式对这些离子进行碎片化处理，同步采集MS/MS质量谱数据，并通过脚本工具筛选出具有高特异性的Quan-PIs。最后，将这些离子对用于构建伪靶向分析方法，并通过多次进样实现对目标脂质的准确定量。这种方法不仅提高了分析效率，还确保了数据的高质量，为后续的生物信息学分析提供了可靠的基础。

值得注意的是，本研究中所使用的脂质标准品均为经过严格验证的高纯度样品，能够有效保证定量分析的准确性。实验过程中所采用的溶剂和试剂均为LC-MS级，确保了样品处理和检测过程的稳定性。同时，实验所用的仪器设备具备良好的分辨率和灵敏度，能够满足HRMS和QQQ MS在不同模式下的分析需求。通过这种方法，研究人员能够更全面地了解脂质在不同条件下的变化情况，从而为疾病的诊断和治疗提供科学依据。

综上所述，MHPL方法的提出为脂质组学研究提供了一种新的技术路径。它不仅克服了传统HRMS和QQQ MS在分析能力上的局限性，还提高了实验的效率和数据的准确性。通过将高分辨率质谱与多路复用模式相结合，该方法能够在较短时间内实现对大量脂质分子的定量分析，适用于多种生物样本和疾病研究。未来，随着技术的进一步发展和优化，MHPL方法有望在更广泛的领域中得到应用，推动脂质组学研究的深入发展。