基于MALDI-TOF-MS的高通量糖基化筛选方法在生物药开发中的创新应用

《Communications Chemistry》：High-throughput glycosylation screening method for biologics development using MALDI-TOF-MS

　　本研究针对生物药糖基化分析通量低、定量准确性不足的瓶颈，开发了基于MALDI-TOF-MS的全糖组内标法。通过优化96孔板兼容的Sepharose CL-4B纯化流程，实现了单次实验192样本的高精度分析（CV~10%）。该方法在曲妥珠单抗和EPO等复杂糖蛋白的质控中展现出优异线性（R2>0.99）与稳定性，为从克隆筛选到批次放行的全流程糖基化监控提供了高效解决方案。

　　

在生物制药领域，糖基化作为蛋白质药物的关键质量属性，直接影响药物的疗效、稳定性和安全性。单克隆抗体（mAbs）和促红细胞生成素（EPO）等生物药中，糖基化模式能调控抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）、补体依赖性细胞毒性（CDC）等关键药理作用，或影响药物的生物活性、药代动力学和免疫原性。然而，随着生物类似药的快速发展及创新生物药的不断涌现，传统糖基化分析方法在通量、速度和定量准确性方面已难以满足大规模质控需求。

为解决这一瓶颈，复旦大学张伟龙团队在《Communications Chemistry》发表研究，开发了一种整合MALDI-TOF-MS快速分析优势与全糖组内标定量策略的高通量糖基化筛选平台。该技术通过用Sepharose CL-4B微球替代传统棉纤维亲水相互作用固相萃取（Cotton HILIC SPE），实现了96孔板格式的自动化样本处理，将单次实验通量提升至192样本，同时保证分析精度（变异系数CV≈10%）和宽线性范围（R²>0.99）。

研究团队通过还原性同位素标记技术构建了覆盖全糖组的内标库，使每个天然糖苷均对应一个质量增加3 Da的内标参照物。这种设计有效克服了MALDI-TOF-MS定量重现性差的固有难题。在方法学验证中，以曲妥珠单抗（赫赛汀^?）为模型，该方法展现出优异特异性（缓冲液对照无干扰峰）、重复性（日内CV 6.44%-12.73%）和三日间精密度（CV 8.93%-12.83%）。线性评估显示，在75倍浓度梯度内各糖苷的R²值均高于0.98，其中G2F糖苷的绝对定量标准曲线R²达0.9989。

内标定量法的优势在加标实验中尤为突出：当向人血清IgG样本中外源添加G0F糖苷时，内标法准确捕获了G0F的选择性升高（其他糖苷水平不变），而无内标的标准相对定量法则错误显示所有非加标糖苷比例下降。这一对比证实内标策略能避免“总和100%”造成的系统偏差，精准反映糖谱的真实变化。

在克隆筛选场景中，该方法成功区分了四个曲妥珠单抗生产批次间低丰度糖苷的细微差异。例如，G0F-GN糖苷在批次1和批次3的含量分别为0.20%和0.12%，0.08%的微小差异仍可被可靠检测（CV<12.8%）。而对于高甘露糖（Man5）等需严格控制的糖型（工艺要求<2%），内标法显著提升了低丰度糖苷的定量稳健性，变异系数较无内标法降低3-5倍。

针对唾液酸稳定性挑战，研究团队通过衍生化保护策略实现了α2,3连接唾液酸糖苷（G1F+SA、G2F+SA）的稳定检测，三日CV值分别为9%和13.2%，与非唾液酸化糖苷相当。此外，该方法在复杂糖蛋白EPO的N-糖分析中同样表现优异，对H6N2P1、H5N4F1S2等8种复杂糖苷的三日精密度CV平均值为8.45%，线性验证R²>0.97，展现了广泛的适用性。

关键技术方法包括：基于肽N-糖苷酶F（PNGase F）的N-糖链释放、Sepharose CL-4B亲水相互作用固相萃取纯化、乙基二甲基氨基丙基碳二亚胺（EDC）介导的唾液酸衍生化保护、钠硼氘化物（NaBD₄)还原同位素标记内标制备，以及超二代2,5-二羟基苯甲酸（super-DHB）基质辅助的MALDI-TOF-MS正离子反射器模式检测。实验样本涵盖商业曲妥珠单抗（罗氏）、EPO（三生制药）及合作企业提供的单克隆细胞系培养产物。

特异性

通过对比曲妥珠单缓冲液与样本质谱图，确认N-糖区无干扰峰，方法特异性良好。

重复性与中间精密度

曲妥珠单抗样本的六次重复分析CV为6.44%-12.73%（平均10.41%），三日间精密度CV为8.93%-12.83%（平均10.78%），表明方法稳定性优异。

线性范围

75倍浓度梯度内各糖苷R²>0.9818，G2F绝对定量标准曲线在0.78-6.25 nmol范围内R²=0.9989。

内标定量优势

Sepharose与棉纤维SPE谱图高度一致，内标法可准确识别G0F加标引起的选择性变化，避免相对定量法的系统误差。

细胞系筛选应用

在四个单克隆细胞系产生的曲妥珠单抗中，内标法可检测0.08%的糖苷含量差异，低丰度糖苷（<10%）定量CV较无内标法降低50%以上。

唾液酸检测稳定性

衍生化保护后唾液酸化糖苷的三日CV≤13.2%，方法适用于α2,3/α2,6连接唾液酸异构体区分。

其他糖蛋白生物药应用

EPO的八种复杂N-糖苷分析显示良好精密度（平均CV 8.45%）和线性（R²>0.97），证明方法跨糖蛋白类型的普适性。

该研究建立的MALDI-TOF-MS糖基化筛选平台，通过全糖组内标策略与高通量样本前处理技术的创新结合，实现了生物药糖基化分析的“速度-通量-精度”三重突破。其应用场景覆盖早期克隆筛选、工艺优化、生物类似药相似性评价及批次放行质控，为糖蛋白药物开发提供了兼具定量严谨性与操作实用性的解决方案。该方法有望成为传统色谱分析技术的重要补充，推动生物药质量控从“事后检测”向“过程监控”的范式转变。