利用生物正交点击交联明胶水凝胶，在体外对淋巴管生成进行三维建模

《Materials Today Bio》：Three-dimensional modelling of lymphangiogenesis in-vitro using bioorthogonal click-crosslinked gelatin hydrogels

　　淋巴管生成体外模型构建及机制研究。利用点击化学修饰的明胶水凝胶（GelTN）建立三维模型，发现低浓度（6% w/v）GelTN因弹性模量较低（1.4 kPa）显著促进人真皮淋巴内皮细胞（HDLEC）的管状突起形成，其机制涉及β3整合素介导的细胞-基质相互作用及MMP14依赖的基质降解。实验表明，GelTN可缓释VEGF-C并维持其生物活性，且在体内小鼠模型中成功诱导新生淋巴管形成。

　　淋巴管生成（lymphangiogenesis）是指在已有淋巴管基础上形成新的淋巴管的过程，对于维持组织稳态和免疫功能至关重要。尽管近年来在理解调控淋巴管生成的分子机制方面取得了显著进展，大多数体外研究仍依赖于传统的二维（2D）细胞培养模型，这种模型在复制调控淋巴管生成的复杂微环境方面存在局限。为了更好地模拟体内微环境，研究人员开发了一种基于明胶的三维（3D）模型，该模型通过点击化学修饰，具有可调的机械特性，为淋巴内皮细胞（LEC）提供了一种仿生且可调控的细胞外基质（ECM）。

研究人员采用点击化学技术对明胶进行改性，引入了四嗪（tetrazine）和环辛烯（norbornene）两种基团，形成了一种新型的明胶基质——GelTN。通过将人真皮淋巴内皮细胞（HDLEC）封装在GelTN中，研究人员建立了一种可靠的体外生成模型，能够用于研究GelTN刚度对淋巴管生成的影响。实验结果显示，在低浓度GelTN中封装的HDLEC在血管内皮生长因子C（VEGF-C）刺激下表现出更强的生成能力，而高浓度GelTN则抑制了这种生成行为。此外，研究还揭示了β3整合素在淋巴管生成中的作用。当β3整合素被抑制时，生成的长度显著减少，且与α5β1整合素的联合抑制进一步减少了生成长度，表明这两种整合素亚基在调控HDLEC与ECM的机械转导过程中存在协同作用。

GelTN水凝胶不仅在体外表现出良好的生物相容性和机械可调性，还在体内实验中展现出应用潜力。实验中，研究人员通过亚皮下注射方式评估了GelTN水凝胶的生物相容性，发现其能够持续释放VEGF-C，并支持细胞迁移和新血管生成。这一结果表明，GelTN水凝胶在组织工程和再生医学中具有广泛的应用前景，特别是在需要控制生长因子释放的治疗领域。

为了进一步验证GelTN水凝胶的性能，研究人员对其进行了多种物理和生物特性测试。通过核磁共振（NMR）分析，研究人员量化了明胶改性的程度，发现GelT和GelN的改性率分别为9.9%±0.2和9.5%±0.3，表明该水凝胶在化学改性方面具有良好的一致性。通过流变学测试，研究人员评估了GelTN水凝胶的交联动力学和机械性能，发现不同浓度的GelTN水凝胶表现出不同的交联时间、最大储能模量（G'）和损耗模量（G''），其中低浓度的GelTN水凝胶表现出更长的交联时间，而高浓度水凝胶则在更短时间内达到交联状态。压缩测试结果显示，GelTN水凝胶的刚度与浓度呈正相关，其弹性模量范围在1.4到5.4 kPa之间，与血管内皮的弹性模量相近，进一步验证了其在模拟体内环境方面的可行性。

为了评估GelTN水凝胶对HDLEC的细胞兼容性，研究人员将HDLEC封装在不同浓度的GelTN水凝胶中，并在体外培养了14天。结果显示，所有浓度的GelTN水凝胶均支持HDLEC的存活和代谢活性，其中低浓度水凝胶（GelTN_Lo）在第5天和第10天表现出更高的代谢活性。通过活/死细胞检测和代谢活性评估，研究人员发现GelTN水凝胶能够维持HDLEC的活性，表明其具有良好的细胞兼容性。

为了进一步研究GelTN水凝胶对HDLEC生成的影响，研究人员使用HDLEC球体作为模型，并将其封装在不同浓度的GelTN水凝胶中。实验结果显示，低浓度GelTN水凝胶（GelTN_Lo）能够显著促进HDLEC球体的生成，而高浓度水凝胶（GelTN_Hi）则抑制了这种生成行为。通过荧光显微镜和共聚焦显微镜观察，研究人员发现低浓度GelTN水凝胶中的HDLEC球体表现出更多的生成和更长的生成长度，而高浓度水凝胶中的HDLEC球体则表现出较少的生成。这一结果表明，水凝胶的刚度对HDLEC生成具有显著影响。

此外，研究人员还探讨了基质金属蛋白酶（MMPs）和整合素在HDLEC生成中的作用。通过RT-qPCR分析，研究人员发现MMP14的表达在低浓度GelTN水凝胶中显著高于高浓度水凝胶。为了验证MMPs对HDLEC生成的调控作用，研究人员使用MMP抑制剂Marimastat处理HDLEC球体，发现其显著抑制了HDLEC的生成，表明MMPs在促进水凝胶降解和生成过程中起关键作用。整合素的表达分析进一步揭示了β3整合素在HDLEC生成中的重要性，而α5β1整合素的抑制则显著降低了生成长度和数量，表明整合素亚基之间的协同作用对HDLEC与ECM的机械转导至关重要。

为了评估GelTN水凝胶作为生长因子载体的潜力，研究人员对其进行了体外和体内释放测试。体外实验显示，GelTN水凝胶能够持续释放VEGF-C，且其释放速率与水凝胶浓度相关。体内实验中，研究人员将GelTN水凝胶注射到小鼠体内，并通过组织学分析评估其生物活性。结果显示，含有VEGF-C的GelTN水凝胶能够促进细胞迁移和新血管生成，表明其在体内具有良好的应用前景。

总体而言，GelTN水凝胶作为一种新型的三维体外模型，不仅能够模拟体内微环境，还能够支持细胞生成和生长因子释放，为研究淋巴管生成提供了重要的工具。此外，其良好的生物相容性和可控的机械性能使其在组织工程和再生医学中具有广阔的应用前景。未来的研究可以进一步优化GelTN水凝胶的机械性能，通过引入更多生物分子（如纤维连接蛋白、层粘连蛋白）来更好地模拟天然组织环境，同时探索多种生长因子的联合使用，以实现更有效的血管生成和淋巴管生成。这些研究将为开发新的治疗策略提供理论基础和技术支持。