蛋白质语言模型驱动的超活性PiggyBac转座酶发现与设计

《Nature Biotechnology》：Discovery and protein language model-guided design of hyperactive transposases

　　为解决基因插入工具靶向性局限和活性不足的问题，研究人员通过真核生物转座子挖掘与蛋白质语言模型（pLLM）优化，发现了高活性PiggyBac转座酶变体，并验证其在T细胞工程和Cas9导向整合中的适用性，为基因治疗与合成生物学提供了高效新工具。

　　

论文解读

基因编辑技术的快速发展为疾病治疗和生物技术应用开辟了新途径，其中高效插入大片段DNA的能力是释放合成生物学潜力的关键。尽管PiggyBac转座酶因其广泛的宿主适应性和大容量基因插入能力而备受关注，但其天然多样性未被充分探索，且存在靶向精度低（依赖TTAA整合位点）和活性不足的局限。传统方法通过生物勘探发现新转座酶，但效率有限。近年来，人工智能尤其是蛋白质语言模型（pLLM）在蛋白质设计中的突破，为优化基因编辑工具提供了新思路。

本研究通过整合大规模基因组数据挖掘与AI驱动设计，显著扩展了PiggyBac转座酶的多样性，并开发出具有超活性的合成变体，相关成果发表于《Nature Biotechnology》。研究团队首先从NCBI和Dfam数据库中筛选了273,643个PiggyBac转座酶开放阅读框，通过结构域（如RNase H-like域、CRD锌指结构）和功能序列（TIR、TSD）过滤，获得116,216个潜在活性序列，聚类后构建包含13,693个亚家族的进化树。进一步利用AlphaFold3进行结构预测，揭示CRD域的两类折叠（HC6H和C5HC2）及其在DNA结合中的功能差异。

为验证功能，研究人员从进化树中选取23个代表序列进行实验，在HEK293T细胞中通过荧光报告系统检测转座活性。结果显示，40%的序列具有活性，其中两个变体（如Poetur和Antgra4）活性与实验室进化版本HyPB相当，且序列相似性低至30%。通过去除N端CKII磷酸化位点，进一步提升了转座效率。此外，这些变体成功适配FiCAT系统（基于Cas9的靶向整合平台），在小鼠C2C12细胞和原代T细胞中实现高效基因插入。

在AI优化方面，团队对ProGen2模型进行微调，使用13,000余个天然序列训练生成新变体。通过多轮筛选（包括结构评分pLDDT、TM-score和深度学习评分ESM1v、ProteinMPNN），从10万生成序列中选出22个候选。实验验证发现，7个变体的切除活性显著优于HyPB，其中seq3277（命名为Mega-PiggyBac）在靶向整合中效率提升2倍，而seq136虽切除活性低但整合效率最高，体现pLLM设计可针对不同功能特性优化。

关键技术方法

研究采用真核基因组数据库（NCBI、Dfam）挖掘PiggyBac序列，通过结构域过滤和聚类分析构建进化树；利用AlphaFold3预测蛋白结构，ProGen2模型生成新序列；功能验证通过荧光报告系统（如切除/整合 assay）、流式细胞术和数字PCR，并在原代T细胞（来源自献血者外周血单核细胞）中测试应用潜力。

研究结果

1. 1.
   PiggyBac多样性扩展：系统发育分析揭示5个主要类群，发现水平基因转移事件和结构域融合现象，如DNA结合域在N端的频繁获得。
2. 2.
   天然变体功能验证：活性转座酶分布广泛，低相似性变体（如Poetur）在T细胞中展示高效整合，兼容FiCAT系统实现位点特异性插入。
3. 3.
   AI设计提升活性：pLLM生成变体结构稳定性（pLDDT>90）和深度学习评分更高，实验证实其切除与整合活性超越HyPB，且靶向性增强。
4. 4.
   治疗应用潜力：合成变体在原发性T细胞中实现稳定基因递送，为CAR-T等细胞疗法提供新工具。

结论与意义

本研究通过生物勘探与AI设计的结合，将PiggyBac转座酶的已知多样性扩大两个数量级，不仅发现了高性能天然变体，还创建了具有超活性的合成版本。这些工具在靶向整合效率和宿主适应性方面的突破，为基因治疗（如遗传病矫正、肿瘤免疫疗法）和合成生物学提供了更精准、高效的基因插入平台。该方法框架可推广至其他基因编辑系统，加速下一代生物技术的开发。